Alat dan Bahan Metode Penelitian

3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai Mei 2011 di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Biokomia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Terpadu IPB Baranangsiang, dan Laboratorium Pengujian Balai Besar Penelitian Pengembangan Pasca Panen Pertanian, Cimanggu, Bogor.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain pisau, termometer, mortar, timbangan digital, cawan porselen, oven, desikator, tabung reaksi, labu takar, gelas erlenmenyer, tabung kjeldahl, buret, tabung sokhlet, pemanas, tanur, rotary evaporator , syringe, dan HPLC. Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah keong “ipong-ipong” F. salmo yang diperoleh dari Desa Gebang Mekar, Kabupaten Cirebon, Provinsi Jawa Barat. Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam analisis antara lain: air, akuades, H 2 SO 4 , NaOH, HCl, tablet kjeltec, H 3 BO 3 , kertas saring, OPA, methanol, merkaptoetanol, brij, pereaksi carrez 1, pereaksi carrez 2, buffer natrium klorida, larutan dansil klorida, metilamin hidroklorida, dan bufer borat.

3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam dua bagian. Bagian pertama meliputi pengambilan sampel, identifikasi, preparasi, penentuan ukuran dan bobot, perhitungan rendemen tubuh, pemasakan, dan uji organoleptik. Bagian kedua meliputi analisis proksimat, asam amino, dan taurin. Diagram alir metode penelitian dapat dilihat pada Gambar 2. 3.3.1 Identifikasi Sampel keong yang telah didapat kemudian diidentifikasi menggunakan buku identifikasi Dance tahun 1977 dengan cara mencocokkan ciri-ciri yang ada dengan buku identifikasi sesuai dengan spesies keong tersebut. 3.3.2 Rendemen Rendemen dihitung sebagai persentasi bobot bagian tubuh keong dari bobot awal. Rumus perhitungan rendemen adalah sebagai berikut: Rendemen = x 100 3.3.3 Perebusan Daging keong segar dipisahkan dari cangkang dan jeroannya, kemudian daging yang telah lembut dimasukkan ke dalam plastik dan ditutup rapat serta diberi kode yang jelas sebagai daging segar. Perebusan dengan air dilakukan selama 30 menit pada suhu 100 ˚C, sebelumnya telah dilakukan penelitian pendahuluan untuk mengetahui waktu dan suhu perebusan yang tepat untuk mendapatkan keong yang matang. Keong diambil dagingnya untuk dimasukkan ke dalam plastik dan ditutup rapat serta diberi kode yang jelas sebagai daging yang telah mengalami perebusan. Sebelum dan setelah proses perebusan selalu dilakukan penimbangan untuk mengetahui ada tidaknya penambahan atau penyusutan berat keong. 3.3.4 Pengukusan Pengukusan dengan air dilakukan selama 45 menit pada suhu 100 ˚C, sebelumnya telah dilakukan penelitian pendahuluan untuk mengetahui waktu dan suhu pengukusan yang tepat untuk mendapatkan keong yang matang. Keong diambil dagingnya untuk dimasukkan ke dalam plastik dan ditutup rapat serta diberi kode yang jelas sebagai daging yang telah mengalami pengukusan. Sebelum dan setelah proses pengukusan selalu dilakukan penimbangan untuk mengetahui ada tidaknya penambahan atau penyusutan berat keong. 3.3.5 Perebusan dengan penambahan garam Keong direbus di dalam air pada suhu 100 ˚C selama 30 menit dengan penambahan konsentrasi garam yaitu 1, 1,5, 2, 2,5, dan 3 dari jumlah air perebusan. Uji hedonik parameter rasa dilakukan untuk mengetahui konsentrasi garam yang paling disukai oleh panelis. Daging keong diberi perlakuan perebusan dan penambahan garam sesuai konsentrasi yang telah diketahui berdasarkan hasil uji hedonik. Sebelum dan setelah proses perebusan selalu dilakukan penimbangan untuk mengetahui ada tidaknya penambahan atau penyusutan berat keong. 3.4 Analisis Kimia Analisis kimia pada keong ipong-ipong terdiri dari analisis proksimat, abu tak larut asam, asam amino, dan taurin. 3.4.1 Analisis proksimat Analisis proksimat yang dilakukan terhadap keong ipong-ipong meliputi kadar air, abu, protein, dan lemak. 1 Analisis kadar air AOAC 1995 Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 ˚C selama 30 menit. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator kurang lebih 30 menit hingga dingin dan ditimbang hingga beratnya konstan. Setelah cawan mempunyai berat yang konstan, cawan dan sampel seberat 1-2 gram ditimbang setelah terlebih dahulu dihomogenkan. Cawan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 102-105 ˚C selama 6 jam. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan hingga dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air adalah sebagai berikut: kadar air = x 100 Keterangan: A = Berat cawan kosong gram B = Berat cawan dengan sampel gram C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan gram 2 Analisis kadar abu AOAC 1995 Cawan abu porselen dikeringkan di dalam oven selama 30 menit dengan suhu 105 ˚C, lalu didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 1-2 gram yang telah dihomogenkan dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Cawan abu porselen dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu sekitar 105 ˚C sampai tidak berasap, selanjutnya cawan tersebut dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 600 ˚C selama 2-3 jam. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih, setelah itu cawan abu porselen didinginkan dalam desikator selama 30 menit, kemudian ditimbang beratnya. Perhitungan kadar abu adalah sebagai berikut: kadar abu = x 100 Keterangan: A = Berat cawan abu porselen kosong gram B = Berat cawan abu porselen dengan sampel gram C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan gram 3 Analisis kadar protein AOAC 1995 Prinsip dari analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar crude protein pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. 1 Tahap destruksi Sampel ditimbang seberat 0,5 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung kjeltec. Satu butir tablet kjeltec dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H 2 SO 4 . Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 ˚C ditambahkan 10 ml air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening. 2 Tahap destilasi Isi labu dituangkan ke dalam labu destilasi, lalu ditambahkan dengan aquades 50 ml. Air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40 sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam erlenmenyer 125 ml berisi larutan H 3 BO 3 dan 3 tetes indikator cairan methyl red dan brom cresol green yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh 200 ml destilat yang bercampur dengan H 3 BO 3 dan indikator dalam erlenmenyer. 3 Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan erlenmeyer berubah warna menjadi pink. Perhitungan kadar protein adalah sebagai berikut: Protein = H H , , FP x 100 Keterangan: FP = Faktor pengenceran 4 Analisis kadar lemak AOAC 1995 Sampel seberat 2 gram W 1 dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya W 2 dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet, lalu dipanaskan pada suhu 40 ˚C dengan menggunakan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ˚C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan W 3 . Perhitungan kadar lemak adalah sebagai berikut: Kadar Lemak = W W W x 100 Keterangan : W 1 = Berat sampel gram W 2 = Berat labu lemak tanpa lemak gram W 3 = Berat labu lemak dengan lemak gram 3.4.2 Analisis kadar abu tak larut asam menurut SNI 2354.1:2010 Abu hasil penetapan kadar abu total dilarutkan dalam 25 ml HCl 10 dan didihkan selama 5 menit. Larutan kemudian disaring dengan kertas saring Whatman bebas abu dan dicuci dengan air suling sampai bebas klorida dengan pereaksi AgNO 3 . Kertas saring kemudian dikeringkan dalam oven. Kertas saring yang sudah dioven kemudian dilipat dengan menggunakan sudip dan diletakkan di dalam cawan porselen yang telah ditimbang bobotnya. Cawan tersebut dibakar di ruang asam sampai tidak berasap. Cawan kemudian dimasukkan dalam tanur selama 6 jam. Cawan lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Kadar abu tak larut asam dapat ditentukan dengan rumus sebagai berikut: kadar abu tidak larut asam = Berat abu g Berat sampel awal g ×100 3.4.3 Analisis asam amino AOAC modifikasi ULFC Shimadzu Komposisi asam amino ditentukan dengan menggunakan HPLC. Langkah pertama yang dilakukan adalah perangkat HPLC harus dibilas dulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Syringe yang akan digunakan juga dibilas dengan aquades. Analisis asam amino dengan menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu: 1 tahap pembuatan hidrolisat protein; 2 tahap pengeringan; 3 tahap derivatisasi; dan 4 tahap injeksi serta analisis asam amino. 1 Tahap pembuatan hidrolisat protein Hal yang dilakukan pada tahap pembuatan hidrolisat protein adalah sampel ditimbang sebanyak 30 mg dan dihancurkan. Sampel yang telah hancur dihidrolisis asam menggunakan HCl 6 N sebanyak 2 ml yang kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 110 ˚C selama 24 jam. Pemanasan dalam oven dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel agar tidak mengganggu kromatogram yang dihasilkan, selain itu pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi hidrolisis. 2 Tahap pengeringan Sampel yang telah dioven selama 24 jam ditambahkan dengan gas nitrogen untuk mempercepat pengeringan dan mencegah oksidasi, kemudian sampel disaring menggunakan gelas masir nomor 2 dan dikeringkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 85 ˚C selama 30 menit. Hal ini dilakukan untuk memisahkan pelarut dengan asam amino. 3 Tahap derivatisasi Larutan derivatisasi dibuat dari campuran ortoftalaldehida OPA 50 mg, methanol 4 ml, merkaptoetanol 0,025 ml, brij-30 30 0,050 ml, dan buffer borat 1 M pH = 10,4. Pereaksi derivatisasi dibuat dengan mencampurkan satu bagian larutan stok dengan dua bagian larutan buffer Kalium Borat pH 10,4. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel. Sampel yang telah dikeringkan ditambahkan dengan 5 ml HCl 0,01 N kemudian disaring menggunakan kertas milipore. 4 Injeksi ke HPLC Hasil saringan diambil dan ditambahkan dengan buffer kalium borat pH 10,4 dengan perbandingan 1:1, kemudian ke dalam vial kosong yang bersih dimasukkan 10 µl sampel dan tambahkan 25 µl pereaksi OPA. Injeksikan 5 µl sampel ke dalam kolom HPLC dan tunggu sampai pemisahan semua asam amino selesai. Waktu yang diperlukan untuk pemisahan sekitar 25 menit. Perhitungan konsentrasi asam amino yang ada pada bahan, dilakukan pembuatan kromatogram standar dengan menggunakan asam amino yang telah siap pakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel. Perhitungan asam amino adalah sebagai berikut: asam amino = FP Keterangan : BM = Bobot molekul dari masing-masing asam amino gmol FP = Faktor pengenceran 250 Kondisi alat HPLC saat dilakukannya analisis asam amino adalah sebagai berikut: Temperatur : 27 ˚C suhu ruang Jenis kolom HPLC : Ultra techspere Kecepatan alir eluen : 1 mlmenit Tekanan : 128 kgfc Fase gerak : Buffer natrium asetat dan methanol 95 Detektor : Fluoresensi Panjang gelombang : Eksitasi : 350 nm Emisi : 400 nm 3.4.4 Analisis kandungan taurin AOAC 1999 Kandungan taurin dapat dianalisis menggunakan alat HPLC dengan beberapa tahapan sebagai berikut : Sampel ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukkan ke labu ukur 100 ml, kemudian ditambah 80 ml air suling dan 1 ml pereaksi Carrez 1 lalu kocok hingga homogen. Sampel yang telah homogen kemudian ditambahkan 1 ml pereaksi Carrez 2, kemudian kocok hingga homogen. Sampel yang telah ditambahkan pereaksi Carrez 1 dan 2 kemudian dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan air suling sampai tanda tera labu ukur dan kocok hingga homogen. Sampel disaring menggunakan kertas saring Whatman. Filtrat ditampung dengan erlenmeyer dan disimpan ditempat gelap. Tahap selanjutnya adalah tahap derivatisasi yaitu dengan mengambil 10 ml ekstrak sampel dimasukkan ke labu takar 10 ml, kemudian ditambahkan 1 ml buffer natrium karbonat dan 1 ml larutan dansil klorida. Sampel didiamkan selama 2 jam lalu dikocok dan ditambahkan 0,5 ml larutan metilamin hidroklorida dan air suling sampai tanda tera 10 ml, kemudian dikocok kembali hingga homogen. Hasil derivatisasi diambil sebanyak 20 µl kemudian diinjeksikan ke HPLC untuk mengetahui kandungan taurin pada sampel. Kandungan taurin dalam 100 gram bahan dapat dihitung dengan rumus : taurin = x Keterangan : C = Konsentrasi standar asam amino µgml Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino dan taurin sebagai berikut : Temperatur : 27 ˚C suhu ruang Jenis kolom HPLC : Pico tag 3,9x150 nm column Kecepatan alir eluen : 1,5 mlmenit Tekanan : 3000 psi Fase gerak : Asetonitril 60 dan buffer natrium asetat 1 M Detektor : UV Panjang gelombang : 272 nm

3.6 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Steel dan Torrie 1993