commit to user 28
G. Rancangan Penelitian
1. Uji Pendahuluan
Gambar 2 . Skema Uji Pendahuluan
Biakan Trichophyton mentagrophytes diinokulasikan pada media Sabouroud Dextrosa
Agar 5 cawan Petri
Dibuat 4 sumuran dengan diameter 6 mm pada setiap cawan untuk pemberian perlakuan
Kontrol - Akuades
Perasan kulit jeruk purut dengan konsentrasi 20, 40,
60, 80, dan 100
Diinkubasikan selama 4 hari pada suhu kamar
Diameter zona hambat diukur Kontrol +
Flukonazol 25 µg
commit to user 29
2. Uji Penelitian
Gambar 3 . Skema Uji Penelitian
Catatan: Uji penelitian diulang sebanyak 3 kali dengan perasan kulit jeruk purut yang berbeda. Hal ini dilakukan untuk memperkecil penyimpangan
kualitas perasan yang dapat mempengaruhi hasil penelitian. Dibuat 5 sumuran dengan diameter 6 mm pada
setiap cawan untuk pemberian perlakuan
Kontrol - Akuades
Perasan kulit jeruk purut dengan konsentrasi 70, 80,
90, dan 100. Masing- masing diulang 5 kali
Diinkubasikan selama 4 hari pada suhu kamar
Diameter zona hambat diukur Kontrol +
Flukonazol 25 µg
Biakan Trichophyton mentagrophytes diinokulasikan pada media Sabouroud Dextrosa
Agar 7 cawan Petri
Uji Kruskal Wallis
Uji Mann Whitney
commit to user 30
H. Alat dan Bahan
1. Alat Penelitian a. Cawan Petri dengan diameter 10 cm
b. Oshe kolong c. Tabung reaksi
d. Beaker glass e. Alat pembuat sumuran berdiameter 6 mm
f. Pipet g. Mikropipet
h. Penggaris i. 0,5 standar Mc Farland
j. Autoklaf k. Lampu spiritus
l. Kertas saring m. Saringan plastik
n. Blender 2. Bahan Penelitian
a. Biakan Trichophyton mentagrophytes b. Sabouroud Dextrose Agar SDA
c. Perasan kulit jeruk purut d. Akuades
e. Diflucan yang mengandung 50 mg flukonazol 1 kapsul f. Alkohol 96
g. NaCl 0,9
commit to user 31
h. Kloramfenikol
I. Cara Kerja
1. Uji Pendahuluan a. Tahap Persiapan
1 Perasan Kulit Jeruk Purut Mencuci bersih jeruk purut terlebih dahulu dengan
menggunakan air mengalir, tujuannya untuk menghilangkan kotoran yang menempel. Kemudian merendamnya di dalam
alkohol 96 agar jeruk purut lebih steril dan bebas dari kontaminasi. Mengupas jeruk purut untuk diambil bagian kulitnya
saja. Selanjutnya melumatkan 100 gram irisan kulit jeruk purut tersebut menggunakan blender dengan dicampur 100 ml akuades.
Hasil dari proses pelumatan kemudian diperas dan disaring dua kali. Penyaringan pertama dilakukan dengan saringan plastik yang
dilapisi kain, kemudian penyaringan berikutnya dengan kertas saring untuk mendapatkan hasil perasan air yang bagus dan tanpa
endapan. Air hasil saringan dianggap konsentrasi 100. 2 Pembiakan Trichophyton mentagrophytes
Biakan jamur diperoleh dari laboratorium Mikrobiologi Universitas Setia Budi Surakarta. Trichophyton mentagrophytes
yang diperoleh merupakan biakan subkultur 5 hari dalam Sabouraud Dextrosa Agar Slant.
commit to user 32
b. Tahap Uji Pendahuluan 1 Persiapan preparat obat flukonazol 25 µg
Preparat flukonazol yang dipakai adalah Diflucan. Satu kapsul Diflucan mengandung 50 mg flukonazol. Satu kapsul flukonazol
50 mg dilarutkan dengan 100 ml akuades. Pengenceran ini adalah pengenceran pertama.
ó 50 mg dlm 100 ml ó 0,5 mg 1 ml
ó 500 µg 1 ml Kemudian dengan rumus :
N
1
· V
1
= N
2
· V
2
500 · V
1
= 25 · 100 V
1
= 5 ml Jadi, untuk mendapatkan kadar flukonazol 25 µg, 5 ml dari hasil
pengenceran pertama dilarutkan ke dalam 100 ml akuades V
2
. Zona sensitivitas flukonazol 25 µg berdasarkan standar yang
ada adalah sebagai berikut: Flukonazol
: ≥ 19 mm
= sensitif :
13 – 18 mm = intermediate
: ≤ 12
= resisten Barry Brown, 1996
2 Pembuatan Sabouraud Dextrose Agar Menyiapkan Sabouraud Dextrose Agar bubuk 10 gram
kemudian menambahkannya dengan akuades 150 ml, lalu V1 = Volume yang tersedia
N1 = Kadar flukonazol awal V2
= Volume
yang akan
digunakan N2 = Kadar flukonazol akhir
commit to user 33
memanaskan sambil mengaduk sampai tercampur homogen. Menambahkan kloramfenikol pada media cair untuk mencegah
tumbuhnya kuman kontaminan. Setiap 1000 ml Sabouraud Dextrose Agar cair memerlukan 400 mg kloramfenikol, maka:
Kloramfenikol yang diperlukan untuk 150 ml Sabouraud Dextrose Agar = 150 ml x 400mg = 60 mg
1000 ml Setiap 250 mg kloramfenikol dilarutkan dalam 10 ml NaCl 0,9.
Maka: NaCl 0,9 yang diperlukan = 60 mg x 10 ml = 2,4 ml
250 mg Bridson, 1998
Jadi memerlukan 60 mg kloramfenikol untuk melarutkan dalam 2,4 ml NaCl 0,9.
Kemudian setelah itu mensterilkan media cair yang telah ditambah larutan kloramfenikol dengan autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit bersama dengan peralatan penelitian lain yang
dibutuhkan. Menuangkan Sabouraud Dextrosa Agar cair dalam 5 cawan Petri yang telah disterilkan dan membiarkan sampai dingin.
3 Pembuatan suspensi dan inokulum Trichophyton mentagrophytes Mengambil biakan Trichophyton mentagrophytes dengan
menggunakan oshe steril kemudian memasukkan ke dalam larutan NaCl 0,9 sampai mencapai kekeruhan yang ekivalen dengan 0,5
standart Mc Farland. Menginokulasikan sampel cair Trichophyton
commit to user 34
mentagrophytes sebanyak 0,2 ml ke dalam tiap-tiap cawan Petri yang berisi Sabouraud Dextrose Agar. Menggoyang agar untuk
meratakan sampel Trichophyton mentagrophytes. 4 Pengenceran perasan kulit jeruk purut
Mengencerkan hasil perasan kulit jeruk purut yang telah disiapkan saat tahap persiapan uji pendahuluan. Perasan diencerkan
dengan akuades sehingga diperoleh konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100. Penentuan konsentrasi tersebut berdasar dari hasil
penelitian yang telah dilakukan oleh Hidayah dan Subakir 2010 mengenai efektifitas air perasan buah jeruk purut 25 terhadap
pertumbuhan Malassezia sp. Pembuatan perasan konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 tersebut berasal dari pengenceran air
perasan konsentrasi 100. Adapun cara pengencerannya menurut Ahmad 1996 sebagai berikut:
- Perasan konsentrasi 20 berasal dari 20 ml perasan konsentrasi 100 + akuades 100ml.
- Perasan konsentrasi 40 berasal dari 40 ml perasan konsentrasi 100 + akuades 100ml.
- Perasan konsentrasi 60 berasal dari 60 ml perasan konsentrasi 100 + akuades 100ml.
- Perasan konsentrasi 80 berasal dari 80 ml perasan konsentrasi 100 + akuades 100ml.
- Perasan konsentrasi 100 merupakan perasan asli yang tidak perlu diencerkan
commit to user 35
5 Memberi perlakuan ke dalam 5 cawan Petri dengan perasan kulit jeruk purut, akuades, flukonazol 25 µg
Langkah pertama dalam tahap ini adalah membuat 4 sumuran berdiameter 6 mm pada masing-masing cawan Petri. Pada masing-
masing sumuran diisi 0,05 ml akuades sebagai kontrol negatif, 0,05 ml flukonazol 25 µg sebagai kontrol positif, dan 0,05 ml perasan
kulit jeruk purut dengan konsentrasi berbeda-beda, yaitu 20,
40, 60, 80, dan 100. Selanjutnya diinkubasi pada suhu kamar selama 4 hari. Setelah
diinkubasi, dilakukan pengukur diamater daerah yang bening zona hambatan dengan menggunakan penggaris melewati pusat
sumuran. 2. Uji Penelitian
a. Tahap Persiapan 1 Perasan Kulit Jeruk Purut
Mencuci bersih jeruk purut terlebih dahulu dengan menggunakan air mengalir, tujuannya untuk menghilangkan
kotoran yang menempel. Kemudian merendamnya di dalam alkohol 96 agar jeruk purut lebih steril dan bebas dari
kontaminasi. Mengupas jeruk purut untuk diambil bagian kulitnya saja. Selanjutnya melumatkan 100 gram irisan kulit jeruk purut
tersebut menggunakan blender dengan dicampur 100 ml akuades. Hasil dari proses pelumatan kemudian diperas dan disaring dua
kali. Penyaringan pertama dilakukan dengan saringan plastik yang
commit to user 36
dilapisi kain, kemudian penyaringan berikutnya dengan kertas saring untuk mendapatkan hasil perasan air yang bagus dan tanpa
endapan. Air hasil saringan dianggap konsentrasi 100. 2 Pembiakan Trichophyton mentagrophytes
Memperoleh biakan jamur diperoleh dari laboratorium Mikrobiologi Universitas Setia Budi Surakarta. Trichophyton
mentagrophytes yang diperoleh merupakan biakan subkultur 5 hari dalam Sabouraud Dextrosa Agar Slant.
b. Tahap Uji Penelitian 1 Penentuan besar ulangan
Dihitung dengan rumus Federer n-1 t-1 15
Keterangan n : besar ulangan
t : jumlah kelompok perlakuan Karena pada penelitian ini menggunakan 6 kelompok perlakuan,
maka : n-1 t-1 15
n-1 6-1 15 5n 20
n 4 Jadi, untuk setiap kelompok, jumlah pengulangan harus lebih dari
4. Dalam penelitian ini menggunakan 5 kali ulangan dalam setiap kelompok.
commit to user 37
2 Pembuatan Sabouraud Dextrose Agar Menyiapan Sabouraud Dextrose Agar bubuk 13 gram dan
menambahkan akuades 200 ml, lalu memanaskan sambil mengaduk
sampai tercampur
homogen. Menambahkan
kloramfenikol pada media cair untuk mencegah tumbuhnya kuman kontaminan. Setiap 1000 ml Sabouraud Dextrose Agar cair
memerlukan 400 mg kloramfenikol, maka: Kloramfenikol yang diperlukan untuk 150 ml Sabouraud Dextrose
Agar = 200 ml x 400mg = 80 mg 1000 ml
Setiap 250 mg kloramfenikol dilarutkan dalam 10 ml NaCl 0,9, Maka:
NaCl 0,9 yang diperlukan = 80 mg x 10 ml = 3,2 ml 250 mg
Bridson, 1998 Jadi diperlukan 80 mg kloramfenikol dilarutkan dalam 3,2 ml NaCl
0,9. Kemudian mensterilkan media cair yang telah ditambah larutan
kloramfenikol dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit
bersama dengan peralatan penelitian lain yang dibutuhkan. Menuangkan Sabouraud Dextrosa Agar cair dalam 5 cawan Petri
yang telah disterilkan dan membiarkan sampai dingin.
commit to user 38
3 Pembuatan suspensi dan inokulum Trichophyton mentagrophytes Memperoleh biakan jamur dari Laboratorium Mikrobiologi
Universitas Setia Budi Surakarta. Trichophyton mentagrophytes yang diperoleh merupakan biakan sub kultur 5 hari dalam
Sabouraud Dextrose Agar miring. Mengambil biakan dengan menggunakan oshe steril kemudian memasukkan ke dalam larutan
NaCl 0,9 sampai mencapai kekeruhan yang ekivalen dengan 0,5 standart Mc Farland. Menginokulasikan sampel cair Trichophyton
mentagrophytes sebanyak 0,2 ml ke dalam tiap-tiap cawan petri yang berisi Sabouraud Dextrose Agar. Menggoyang agar untuk
meratakan sampel Trichophyton mentagrophytes. 4 Pengenceran perasan kulit jeruk purut
Mengencerkan hasil perasan kulit jeruk purut yang telah disiapkan pada saat tahap persiapan uji pendahuluan sehingga
diperoleh konsentrasi 70, 80, 90 dan 100. 5 Memberi perlakuan ke dalam 7 cawan Petri dengan perasan kulit
jeruk purut, akuades dan flukonazol 25 µg Langkah pertama dalam tahap ini adalah membuat 5 sumuran
berdiameter 6 mm pada masing-masing cawan Petri. Pada masing- masing sumuran diisi 0,05 ml akuades sebagai kontrol negatif, 0,05
ml flukonazol 25 µg sebagai kontrol positif, dan 0,05 ml perasan kulit jeruk purut dengan konsentrasi 70, 80, 90, 100.
Selanjutnya diiinkubasi pada suhu kamar selama 4 hari. Setelah diinkubasi, dilakukan pengukuran diamater daerah yang bening
commit to user 39
zona hambatan dengan menggunakan penggaris melewati pusat sumuran.
Mengulang tahap penelitian poin a dan b dengan perasan kulit jeruk purut yang berbeda. Pengulangan perasan dilakukan
sebanyak 3 kali.
J. Analisis Data
Kategori