gugus hidroksil atau inti flavonoida; isoprenilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida; metilenasi gugus orto-dihidroksil; dimerisasi pembentukan biflavonoid; pembentukan
bisulfat; dan yang terpenting, glikosilasi gugus hidroksil pembentukan flavonoid O- glikosida atau inti flavonoida pembentukan flavonoida C-glikosida. Jadi cakupan
flavonoida yang sudah diketahui luas sekali, dan daftar varian yang telah diketahui telah diperbarui.
2.2.2. Flavonoida O-glikosida
Flavonoida biasanya terdapat sebagai flavonoida O-glikosida; pada senyawa tersebut satu gugus hidroksil flavonoida atau lebih terikat ada satu gula atau lebih dengan ikatan
hemiasetal yang tak tahan asam. Pengaruh glikosilasi menyebabkan flavonoida menjadi kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air cairan; sifat terakhir ini memungkinkan
penyimpanan flavonoida dalam vakuola sel di sinilah biasanya flavonoida berada. Walau pun gugus hidroksil pada setiap posisi dalam inti flavonoida dapat diglikosilasi,
kenyataannya hidroksil pada tempat tertentu mempunyai peluang yang lebih besar untuk terglikosilasi ketimbang tempat-tempat lain, misalnya 7-hidroksil pada flavon, isoflavon,
dan dihidroflavon, 3-dan 7- hidroksil dalam flavonol dan dihidroflavonol; dan 3-dan 5- hidroksil dalam antosianidin. Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat, walau
pun galaktosa, ramnosa, xilosa, dan arabinosa sering juga terdapat. Gula lain yang kadang-kadang ditemukan ialah alosa, manosa, fruktosa, apiosa, dan asam glukuronat.
Disakarida sering juga terdapat terikat pada flavonoida, misalnya soforosa 2-O- β-D-
glukosil-D-glukosa, gentibiosa 6-O- β-D-glukosil-D-glukosa, rutinosa 6-O-a-L-
ramnosil-D-glukosa, neohesperidosa 2-O-a-L-ramnosil-D-glukosa, dan bahkan kadang-kadang tri atau bahkan tetrasakarida. Sudah diakui bahwa dalam tumbuhan O-
glikosilasi dan metilasi terjadi sebagai salah satu tahap akhir pada biosintesis dan dikatalisis oleh enzim yang sangat khas. Ada kalanya glikosida mengalami modifikasi
lebih lanjut, yaitu asilasi. Glikosida terasilasi mempunyai satu gugus hidroksil gula atau lebih yang berkaitan dengan asam seperti asam asetat atau asam ferulat. Dalam hal ini,
ikatannya ikatan ester; asam teresterifikasi secara efektif dengan gula.
2.2.3. Flavonoida C-glikosida
Gula dapat juga terikat pada atom karbon flavonoida dan dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzen dengan suatu ikatan karbon-karbon yang tahan asam
bandingkan dengan O-glikosida. Glikosida yang demikian disebut C-glikosida. Sekarang gula yang terikat pada atom C hanya ditemukan pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti
flavonoida. Jenis gula yang terlibat ternyata jauh lebih sedikit ketimbang jenis gula pada O-glikosida, biasanya dari jenis glukosa yang paling umum misalnya viteksin, orientin,
dan juga galaktosa misalnya 8-C-galaktosida, ramnosa misalnya violantin, xilosa misalnya visenin-1, dan arabinosa misalnya skaftosida. Jenis aglikon flavonoida yang
terlibat pun sangat terbatas. Jadi, walau pun isoflavon, flavanol kadang-kadang terdapat dalam bentuk C-glikosida, sebegitu jauh hanya flavon C-glikosida yang paling lazim
ditemukan. Seperti O-glikosida, C-glikosida ternyata sering mengalami O-glikosilasi lebih lanjut pada hidroksil gula atau fenol atau mengalami asilasi biasanya pada
hidroksil gula. Markham, 1988
2.3. Kromatografi
Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah: 1 kecenderungan
molekul untuk melarut dalam cairan kelarutan, 2 kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus adsoprsi, penjerapan, dan 3 kecenderungan
molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap keatsirian. Pada sistem
kromatografi, campuran yang akan dipisahkan ditempatkan dalam keadaan demikian rupa sehingga komponen-komponennya harus menunjukkan dua dari ketiga sifat tersebut. Ini
mungkin melibatkan dua sifat yang berlainan, misalnya penjerapan dan kelarutan, ata mungkin melibatkan satu sifat pada dua lingkungan, misalnya kelarutan di dalam dua
cairan yang tidak bercampur. Walaupun kromatografi melibatkan proses saling
mempengaruhi antara beberapa sifat secara cergas pendekatan terbaik ialah pertama-tama dengan memperhatikan keadaan pegun.
Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah:
- Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan kelarutan
- Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus adsorbsi,
penjerapan -
Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap keatsirian
Pada sistem kromatografi, campuran yang akan dipisahkan ditempatkan dalam keadaan demikian rupa sehingga komponen-komponennya harus menunjukkan dua dari
ketiga sifat tersebut. Hal ini melibatkan dua sifat berlainan, misalnya penjerapan dan kelarutan, misalnya kelarutan di dalam dua cairan yang tidak bercampur.
Walaupun kromatografi melibatkan proses saling mempengaruhi antara beberapa sifat ialah pertama-tama dengan memperlihatkan pegun. Misalnya memasukkan senyawa
ke dalam corong pisah yang berisi dua pelarut yang masing-masing mempunyai kelarutan yang terbatas dalam pelarut pasangannya misalnya eter dan air, senyawa itu cenderung
terdistribusi atau terpartisi di antara kedua cairan itu atau fase bergantung kepada sifat kelarutannya.
Partisi yang demikian merupakan persaingan antara kelarutan di dalam cairan. Jika dimasukkan linarut ke dalam labu yang berisi cairan dan serbuk bahan padat
misalnya arang, linarut akan terdistribusi di antara permukaan bahan padat dalam hal kedua ini, linarut menunjukkan sifat kejerapannya. Pada akhirnya dimasukkan linarut ke
dalam labu yang sedikit mengandung cairan yang tidak atsiri, linarut akan menunjukkan sifat kelarutan dan keatsirian. Dalam sistem kromatografi, mungkin saja dapat
memperbesar perbedaan itu, walaupun perbedaan itu sangat kecil, dan menjadikannya sebagai dasar pemisahan Gritter, 1991.
2.3.1. Kromatografi Lapisan Tipis
Nilai utama KLT pada penelitian flavonoida ialah sebagai cara analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit. Tulisan mengenai cara KLT sendiri sudah banyak.
Demikian pula mengenai manfaatnya dalam analisis flavonoida. Menurut pengalaman pengarang, KLT terutama berguna untuk tujuan berikut:
1. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom;
2. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom;
3. Menyigi arah atau perkembangan reaksi seperti hidrolisis atau metilasi;
4. Identifikasi flavonoida secara re-kromatografi;
5. Isolasi flavonoida murni skala kecil.
Penjerap dan pengembang yang digunakan umumnya sama dengan penjerap dan pengembang yang telah dibahas secara rinci untuk KKt dan kromatografi kolom dan cara
untuk mendeteksi bercak sebagian besar seperti yang telah diikhtisarkan untuk KKt. Pelat KLT dari plastik terutama dianjurkan karena tembus sinar UV untuk mendeteksi bercak
dan dapat dipotong dengan mudah menjadi sebarang ukuran.
Pelat KLT selulose dapat dibuat dengan menggunakan penyaput KLT baku misalnya Camag, Corning, dll. Selulose mikrokistal Merck, yaitu ‘Avicel’ terutama
sangat cocok untuk keperluan ini dan disaputkan paling baik sampai ketebalan 0,25 cm agar lapisan tidak retak. Untuk menyaput lima pelat 20 x 20 cm, 20 g selulose sudah
cukup diaduk kuat-kuat dengan H
2
O 70 ml selama 5 menit.
2.3.2. Kromatografi Kolom
