ujung, dan ukurannya sedemikian rupa sehingga nisbah garis tengah terhadap panjang kolom dalam rentang 1 : 10 sampai 1 : 30. Ukuran volum yang diperlukan untuk suatu
pemisahan dapat dihitung secara kasar bila bobot campuran flavonoida diketahui. Pada umumnya kita menganggap bahwa untuk pemisahan yang didasarkan pada partisi yaitu
kromatografi pada selulose dan silika, nisbah cuplikan terhadap kemasan kolom harus dalam rentang 1 : 50 sampai 1 : 500; nisbah 1 : 500 cocok untuk campuran rumit dan
nisbah 1 : 50 untuk campuran sederhana. Pada kolom poliamida dan sampai taraf tertentu kolom silika, pengisian cuplikan dalam rentang 1 : 50 umumnya memuaskan.
Kemasan kolom harus dipilih dari jenis yang dipasarkan khusus untuk kromatografi kolom karena ukuran partikel penting. Jika partikel terlalu kecil, laju aliran
pengelusi mungkin terlalu lambat, sedangkan bila terlalu besar, mungkin pemisahan komponen secara kromatografi tidak baik. Kemasan niaga biasanya dalam rentang 100 –
300 mesh. Markham, 1988
2.4. Teknik Spektroskopi
Spektroskopi adalah studi mengenai antaraksi cahaya dengan atom dan molekul. Radiasi cahaya atau elektromagnet dapat dianggap menyerupai gelombang atau korpuskular.
Beberapa sifat fisika cahaya paling baik diterangkan dengan ciri gelombangnya, sedangkan sifat lain diterangkan dengan sifat partikel. Jadi, cahaya dapat dikatakan
bersifat ganda. Creswell, 1981
2.4.1. Spektrofotometri Infra Merah FT-IR
Walaupun spekrum infra-merah merupakan kekhasan sebuah molekul secara menyeluruh, gugus-gugus atom tertentu memberikan penambahan pita-pita pada kerapan tertentu,
ataupun di dekatnya, apapun bangun molekul selebihnya. Keberlakuan seperti itulah yang
memungkinkan kimiawan memperoleh informasi tentang struktur yang berguna serta mendapatkan acuan bagi peta umum frekuensi gugus yang khas.
Pancaran infra-merah yang kerapannya kurang daripada 100 cm
-1
panjang gelombang lebih daripada 100 µm diserap oleh sebuah molekul organik dan diubah
menjadi energi putaran molekul. Penyerapan itu tercatu dan dengan demikian spektrm rotasi molekul terdiri dari garis-garis yang tersendiri.
Pancaran infra-merah di julat antara 10.000 – 10 cm
-1
1 – 100 µm, diserap oleh sebuah molekul organik dan diubah menjadi getaran energi molekul. Penyerapan ini juga
tercatu, namun spektrum getaran tampak bukan sebagai garis-garis melainkan berupa pita-pita. Hal itu disebabkan perubahan energi getaran tunggal selalu disertai sejumlah
perubahan energi putaran. Dengan pita getaran putaran yang khususnya terletak antara 4000 cm
-1
dan 666 cm
-1
X 2,5 – 1,5 µm inilah kimiawan organik berkepentingan. Kerapatan atau panjang gelombang penyerapan bergantung pada massa nisbi, tetapan
gaya ikatan dan geometri tata-ruang atom-atomnya.
Letak pita dalam spektrum infra-merah disajikan sebagai bilangan gelombang atau panjang gelombang. Satuan bilangan gelombang cm
-1
, kebalikan sentimeter lebih sering dipakai karena secara langsung berbanding dengan energi getarannya dan karena
kebanyakan radas mutakhir berskala linear dalam cm
-1
. Panjang gelombang dicatat dalam mikrometer µm, 10
-6
meter walaupun buku-buku lama menyebutnya mikron µ.
Serapan khas dan daerah serapan akan dituliskan dalam cm
-1
, dengan µm yang sesuai mengikutinya biasanya di dalam tanda kurung.
2.4.2. Spektrofotometri Ultra Violet-Visible UV
Serapan molekul di dalam daerah ultra ungu dan terlihat dari spektrum bergantung pada struktur elektronik dari molekul. Penyerapan sejumlah energi, menghasilkan percepatan
dari elektron dalam orbital tingkat dasar ke orbital yang berenergi lebih tinggi di dalam keadaan tereksitasi. Untuk beberapa struktur serapan elektronik tidak terjadi di dalam
daerah ultra ungu. Dalam praktek, spektrometri ultra ungu sebahagian besar dibatasi pada sistem konyugasi. Suatu keuntungan dari serapan ultra ungu adalah selektifitasnya: gugus
yang khas dapat dikenal di dalam molekul dengan kerumitan yang bervariasi luas. Sebahagian besar dari molekul yang relatif rumit kemungkinan bening di dalam ultra
ungu karena itu kita mungkin memperoleh suatu spektra yang sama dengan molekul lain yang jauh lebih sederhana. Jadi, spektrum dari kholest-4en-4-on sangat mirip dengan
spektrum dari mesitil oksida. Serapan dihasilkan dari bagian enon yang terkonyugasi dari kedua senyawa.
Suatu spektrum ultra ungu diperoleh secara langsung dari suatu alat yang secara sederhana memetakan panjang gelombang dari suatu serapan terhadap intesitas serapan
adsorbans atau transmitans. Datanya seringkali diubah menjad suatu grafik dari panjang gelombang terhadap serapan molar
Є
maks
atau log Є
maks
. Penggunaan serapan molar sebagai satuan dari intensitas serapan mempunyai keuntungan bahwa semua harga
intensitas dikembalikan kepada bilangan dari jenis serapan.
2.4.3. Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton
