d. Tabung IV : ditambah dengan H
2
SO
4 p
menghasilkan larutan merah
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia dari Ekstrak Daun Tumbuhan Kedondong Laut
Daun tumbuhan kedondong laut yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ditimbang sebanyak 900 gram, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak 8 liter
selama ± 48 jam, kemudian disaring dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga terbentuk ekstrak pekat metanol. Ekstrak pekat metanol
tersebut dipartisi berulang-ulang dengan menggunakan n-heksana sebanyak 36 kali. Lalu diambil lapisan metanol dan dipekatkan. Lapisan metanol yang diperoleh kemudian
dipekatkan dengan rotarievaporator sampai seluruh metanol menguap, dan terbentuk padatan yang bebas metanol. Padatan tersebut kemudian ditambah dengan etil asetat dan
diaduk. Etil asetat kemudian disaring dan diambil filtratnya dan dipekatkan dengan rotarievaporator sampai terbentuk ekstrak pekat etil asetat sebanyak 30,06 gram.
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis dengan kromatografi lapis tipis dimaksudkan untuk mencari perbandingan pelarut yang sesuai di dalam pemisahan senyawa dengan meningkatkan kepolarannya
dalam kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut kloroform : metanol 9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9 vv, sehingga diperoleh
perbandingan pelarut kloroform : metanol yang sesuai untuk kromatografi kolom.
Pelarut yang sesuai didasarkan kepada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Prosedur: Ke dalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan larutan fase gerak yaitu
campuran pelarut kloroform : metanol dengan campuran pelarut 9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9 vv. Kemudian ekstrak etil asetat ditotolkan pada plat KLT yang
sudah diaktifkan. Lalu plat dimasukkan ke dalam bejana yang berisi pelarut yang
dijenuhkan, kemudian ditutup. Setelah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Noda yang terbentuk diamati dengan sinar ultraviolet dan difiksasi dengan FeCl
3
1. Kemudian dihitung dan dicatat harga Rf. Yang memberikan pemisahan bercak noda yang
baik adalah perbandingan pelarut kloroform : metanol 8:2 vv yang memberikan empat
noda dengan harga Rf yaitu 0,245 ; 0,415 ; 0,622 ; dan 0,830.
3.3.5. Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Dilakukan isolasi senyawa flavonoida terhadap total flavonoida yang telah diperoleh dengan menggunakan kromatografi kolom. Dimana sebagai fase diam yaitu silika gel 60
GF 0,063-0,200 mm E.Merck.Art.7734 dan fase gerak yaitu pelarut kloroform 100 dengan campuran pelarut kloroform : metanol 90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40 ; 50 : 50
; 40 : 60 ; 30 : 70 ; 20 : 80 ; 10 : 90 vv.
Prosedur : Dibersihkan peralatan kromatografi kolom, dibilas dengan metanol, dikeringkan,
dan dirangkai. Kemudian silika gel 60 GF 0,063-0,200 mm E.Merck.Art.7734 sebanyak 300 gram dibuburkan dengan pelarut metanol, diaduk sampai homogen dan dimasukkan
ke dalam kolom kromatografi. Lalu dielusi dengan metanol 100 hingga bubur silika gel memadat dan homogen. Dimasukkan sampel flavonoida sebanyak 10 gram yang telah
dibuburkan dengan silika gel ke dalam kolom kromatografi yang telah diaktifkan. Sampel dibiarkan turun hingga memadat. Kemudian dielusi dengan pelarut kloroform 100 dan
diatur aliran fraksi yang keluar dari kolom kromatografi bergerak secara kontinu dan ditampung tiap fraksi dalam botol vial masing-masing sebanyak 13 ml.
Perlakuan yang sama dilakukan terhadap campuran pelarut antara kloroform : metanol 90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40 ; 50 : 50 ; 40 : 60 ; 30 : 70 ; 20 : 80 ; 10 : 90
vv. Tiap-tiap fraksi yang telah diperoleh dari hasil elusi pelarut kloroform 100 dan variasi pelarut diKLT, lalu digabung fraksi dengan harga Rf yang sama dari perbandingan
pelarut kloroform : metanol 80 : 20 vv, kemudian diuapkan pelarutnya hingga diperoleh kristal
3.3.6. Analisis Kristal Hasil Isolasi