sampel dengan uji skrining fitokimia, yaitu serbuk batang tumbuhan Brotowali ditimbang sebanyak 5 g, dimaserasi dengan 20 ml etanol, selama 2 jam, disaring dan filtrat yang
diperoleh dibagi menjadi 4 bagian, yaitu : Filtrat I
: ditambahkan 2 tetes pereaksi Meyer ternyata terbentuk endapan warna putih, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida.
Filtrat II : ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorf ternyata terbentuk endapan
warna jingga, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida. Filtrat III
: ditambahkan 2 tetes pereaksi Wagner ternyata terbentuk endapan warna coklat, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida.
Filtrat IV : ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat ternyata terbentuk endapan
warna coklat, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida
3.3.3.Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Ekstrak Batang Tumbuhan Brotowali Tinospora crispamiers
Serbuk batang brotowali ditimbang sebanyak 1000 g dimaserasi dengan pelarut etanol 2 L, pekerjaan dilakukan 4 kali, lalu dipisahkan ampas dengan ekstrak. Ekstrak hasil
sokletasi ini kemudian dipekatkan pada rotary evaporator pada suhu 65 C sehingga
diperoleh ekstrak pekat. Ekstrak pekat ini kemudian dipartisi dengan etil asetat : air yang kemudian diambil fraksi air, fraksi air kemudian diasamkan dengan HCL 2 N sampai pH
2, kemudian diaduk selama 3 jam dengan pengaduk magnet, lalu disaring. Larutan hasil pemisahan ini kemudian dibasakan dengan NH
4
OH pekat sampai pH 10, kemudian diekstraksi dengan kloroform : air 1:1 sebanyak 4 kali. Diambil lapisan bawah yang
berupa ekstrak kloroform lalu dicuci dengan aguadest sampai netral, kemudian dikeringkan dengan 15 g MgSO
4
anhidrat, diamkan 1 malam lalu disaring, kemudian diambil larutannya dan dipekatkan dengan rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak
kasar sebanyak 18 g.
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai di dalam analisis kromatografi kolom. Dimana ekstrak kasar yang diperoleh dilakukan analisis secara kromatografi
lapisan tipis dengan pelarut yang digunakan adalah kloroform 100 dan campuran pelarut kloroform : etanol 5 : 1 vv, 4 : 1 vv, 3 : 1 vv, 2 : 1 vv, 1 : 1 vv. Sehingga
akan diperoleh perbandingan pelarut kloroform : metanol yang sesuai untuk kromatografi kolom.
Prosedur :
Ke dalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak kloroform 100 . Ekstrak encer dietil eter ditotolkan pada palat KLT yang diaktifkan.
Plat dimasukkan ke dalam bejana yang berisi developer – developer yang telah dijenuhkan, kemudian ditutup rapat dan dielusi. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari
bejana, dikeringkan. Noda yang terbentuk diamati dengan sinar ultraviolet. Kemudian harga Rf nya dihitung.
Perlakuan yang sama dilakukan untuk campuran pelarut antara kloroform : etanol 5 : 1 vv, 4 : 1 vv, 3 : 1 vv, 2 : 1 vv, 1 : 1 vv. Dari hasil analisis KLT menunjukkan
bahwa batang tumbuhan Brotowali mengandung senyawa alkaloida. Dari hasil pemisahan yang lebih baik diberikan pada fase gerak kloroform : etanol 4 : 1 vv. Harga Rf nya
dapat dilihat pada kromatogram tabel 1
3.3.5. Isolasi Senyawa alkaloida dengan Kromatografi Kolom
Terhadap 18 g ekstrak kasar dilakukan isolasi senyawa alkaloida dengan kromatografi kolom. Fasa diamnya adalah silika gel 60 G E.Merck Art. 7734 dan fasa geraknya
adalah kloroform : etanol 4 : 1 vv. Prosedur :
Peralatan untuk kolomkromatografi dirangkai, terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 G E.Merck. Art. 7734 sebanyak 55 g dengan menggunakan kloroform 100 , diaduk
sampai homogen dan dimasukkan ke dalam kolom kromatografi lalu dielusi dengan
kloroform 100 hingga bubur silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 18 g ekstrak kasar batang tumbuhan brotowali ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur
silika gel. Sampel dibiarkan turun dan terserap dengan baik pada silika gel dipuncak kolom, lalu ditambahkan fase gerak kloroform : etanol 4 : 1 vv secara perlahan –lahan
dan diatur sehingga liran fraksi yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Hasil yang diperoleh ditampung dalam beberapa botol
vial, lalu diuapkan diudara terbuka sampai pelarutnya habis hingga terbentuk kristal alkaloida.
3.3.6. Pemurnian Kristal Hasil Isolasi
Dari analisis taip – tiap fraksi dengan kromatografi lapisan tipis, diperoleh noda – noda dengan harga Rf yang hampir sama, ykni pada fraksi 15 – 30. lalu fraksi tesebut
digabungkan dan diuapkan, diperoleh larutan pekat berwarna Kuning kehijauan. Kemudian dicuci dengan pelarut etanol secara berulang – ulang sebanyak 3 kali,
kemudian dikeringkan hingga terbentuk kristal berwarna kuning berbentuk jarum sebanyak 1,38 g
3.3.7. Analisis Kristal Hasil Isolasi
3.3.7.1. Analisis Pada Kromatografi Lapis Tipis
