adalah bahan cuplikan harus mempunyai tekanan uap paling tidak beberapa torr pada suhu kolom. Sistem ini sangat baik sehingga dapat dikatakan sebagai metoda pilihan
dalam kromatografi karena dapat memisahkan dengan cepat dan peka Sudjadi, 1986 .
Kromatografi adalah suatu tekhnik pemisahan tertentu dengan menggunakan dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari dua
fasa ini. Cara- cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat- sifat dari fasa gerak, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa tetap berupa zat padat maka
cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan absorption chromatography dan jika zat cair maka kromatografi tersebut dikenal dengan kromatografi partisi partition
chromatography.
Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat di laboratorium kimia. Gagasan dasarnya sederhana untuk dipahami; caranya beragam,
mulai dari cara yang sederhana sampai yang agak rumit dari segi kerja dan peralatan, dan metode ini dapat dipakai untuk setiap jenis senyawa Sastrohamidjojo,1985.
2.3.1.1. Kromatografi Kertas
Satu keuntungan utama kromatografi kertas ialah kemudahan dan kesederhanaannya pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai
medium pemisahan dan juga penyangga. Keuntungan lain ialah keterulangan bilangan Rf yang besar pada kertas sehingga penggukuran Rf merupakan parameter yang berharga
dalam memaparkan senyawa tumbuhan baru.
Kromatografi pada kertas biasanya melibatkan kromatografi pembagian atau penjerapan. Pada kromatografi pembagian, senyawa terbagi dalam pelarut alkohol yang
sebagian besar tidak bercampur dengan air misalnya n-butanol dan dalam air. Sebaliknya gaya jerap merupakan salah satu ciri utama kromatogarafi kertas dalam
pengembang air. Air murni ialah pengembang kromatografi yang sungguh-sungguh serba
guna dan dapat digunakan untuk memisahkan purina dan pirimidina biasa, dan secara umum dapat dipakai juga untuk senyawa fenol dan glikosida tumbuhan. Harbone,1987.
2.3.1.2.Kromatografi Lapisan Tipis
Kromatografi lapis tipis merupakan pemisahan komponen komponen berdasrkan adsorpsi atau partisi oleh fasa diam dibawah gerakan pelarut pengembang atau pelarut
pengembang campuran. Pemilihan pelarut pengembang atau pelarut pengembang campuran sangat dipengaruhi oleh macam polaritas zat – zat kimia yang dipissahkan.
Fasa diam yang umum dan banyak dipakai adalah silika gel yang dicampur dengan CaSO
4
untuk menambah daya lengket partikel silika gel.Mulja,1995
Teknik ini dikembangkan tahun 1939 oleh Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fasa diam. Fasa
bergerak akan merayap sepanjang fasa diam dan terbentuklah kromatogram. Biasanya yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya adaqlah silika gel, tetapi kadangkala
bubuk selulosa dan tanah diatomae, kieselguhr dapat juga digunakan. Pemilihan sistem pelarut dan komposisi lapisan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi yang akan
digunakan. Sampel diteteskan pada salah satu bagian tepi plat kromatografi sebanyak
0,01 - 10µg zat.
Zat-zat bewarna dapat terlihat langsung, tetapi dapat juga digunakan reagen penyemprot untuk melihat bercak suatu noda. Untuk menempatkan posisi suatu zat,
reagen dapat juga disemprotkan pada bagian tepi saja. Bagian yang lain dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran dari reagen dengan pengerokan setelah pemisahan selesai.
Aplikasi KLT sangatlah luas. Senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT Khopkar, 2002 .
Kromatografi Lapisan Tipis KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Yang pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif
dan preparatif. Kedua dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi.
Pada hakikatnya Kromatografi Lapisan Tipis melibatkan dua peubah: sifat fasa diam atau sifat lapisan dan sifat fase gerak atau campuran pelarut pengembang. Fasa
diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap kromatografi cair-padat atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair
kromatografi cair- cair. Fasa diam pada KLT sering disebut penyerap, walaupun sering berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair di dalam sistem kromatografi cair-
cair. Hampir segala macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT, yaitu: silika gel asam silikat, alumina aluminium oksida, kiselgur tanah diatome, dan
selulosa. Fasa gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau campuran pelarut.
Gritter,1991
Pelarut-pelarut
Pemilihan pertama dari pelarut ialah bagaimana sifat kelarutnnya. Tetapi sering lebih baik untuk memilih suatu pelarut yang tak tergantung daripada kekeuatan elusi sehingga
zat-zat elusi yang lebih kuat dapat dicoba. Yang dimaksud dengan kekuatan dari zat elusi adalah daya penyerapan pada penyerap dalam kolom. Biasanya untuk penyerap-penyerap
yang polar seperti alumina dan silika gel, maka kekuatan penyerap naik dengan kenaikan polaritas dari zat yang diserap. Menurut TRAPPE, kekuatan elusi dari dari deret-deret
pelarut untuk senyawa-senyawa dalam kolm dengan menggunakan silika gel akan diturunkan dalam urutan sebagai berikut : airmurni metanol etanol propanol
aseton etil-asetat dietil-eter kloroform metilena klorida benzena toluena trikloroetilena karbontetraklorida sikloheksana heksana.
Kekuatan dari pelarut-pelarut yang berbeda menurut WILLIAMS, pada karbon aktif dalam kolom untuk asam-asam amino dan sakarida-sakarida diturunkan dalam
urutan : etil asetat dietil eter propanol aseton etanol metanol air murni.
Urutan ini adalah dari kenaikan polaritas atau penurunan panjang rantai dari homolog. Sedangkan untuk alumina dan silika gel urutannya ada sebaliknya. Kemurnian
dari pelarut-pelarut harus setinggi mungkin. Kemungkinan yang paling populer dan biasanya digunakan sebagai penyerap
adalah alumina, tetapi hal ini tak berarti bahwa yang lain tak dapat digunakan. Suatu pengertian yang digunakan dalam hubungannya dengan penyerap-penyerap
adalah aktifas. Kadang-kadang ia dihubungkan dengan luas permukaaan spesifik dari zat padat, yaitu luas permukaan yang diukur dalam meter persegi tiap gram, dalam hal
karbon, silika gel dan alumina dapat dibuat menjadi menjadi aktif dengan memiliki permukaan spesifik beratus-ratus meter persegi.
Sedangkan seperti kalsium karbonat dan kalsium hidroksida, mempunyai permukaan spesifik yang mempunyai ukuran dalam puluhan meter persegi atau kurang
sehingga mereka dikategorikan relatif tak aktif. Pada keadaan lain, pengertian ”aktifitas” sering digunakan untuk menyatakan kekuatan dari serapan dan ini yang biasa digunakan
dalam kromatografi. Aktifitas kromatografi adalah spesifik yang mempunyai pengertian zat padat dengan luas permukaan yang besar menyerap dengan kuat. Telah diketahui
bahwa kekuatan serapan dari gugus polar pada senyawa-senyawa polar naik dalam urutan :
-COOR, = C = 0, -NH
2
Banyak penyerap seperti alumina, silika gel, karbon aktif, dan magnesium silikat dapat diperoleh dalam perdagangan. Mereka sering memerlukan aktivasi sebelum
dipakai; hal ini dapat dikerjakan dengan pemanasan, mungkin dengan pengurangan tekanan. Suhu optimum untuk aktvasi aluminium biasanya sekitar 400
, -OH, -COOH.
o
C dan waktu pemanasan cukup selama 4 jam. Untuk kebanyakan zat-zat padat, dengan tak ada
keterangan lebih lanjut pemanasan pada suhu 200
o
C selama 2 jam.
Zat-zat aktif yang digunakan sebagai penyerap dalam kromatografi kolom merupakan katalisator yang baik; ini merupakan bahaya yang perlu mendapat perhatian.
Alumina, terutama bila bersifat alkali, sering menyebabkan perubahan kimia dan menimbulkan reaksi-reaksi; sebagai misal, ia dapat menyebabkan kondensasi dari
aldehida-aldehida dan keton-keton, hingga bila hal ini terjadi, maka harus menggunakan alumina yang bersifat netral. Silika gel dapat menyebabkan isomerisasi dari berbagai
senyawa-senyawa seperti terpen dan sterol Sastrohamidjojo, 1985.
2.3.1.3.Kromatografi Kolom
Ada empat jenis kromatografi yang dapat dimasukkan dalam kromatografi kolom, yaitu kromatografi adsorbsi, kromatografi pertukaran ion, kromatografi partisi, dan
kromatografi filtrasi gel. Secara umum dapat digambarkan,bahwa kromatografi tersebut dilaksanakan dalam suatu kolom yang diisi dengan fase stasioner yang porous. Cairan
dipakai sebagai fase mobil untuk mengelusi komponen sampel keluar melalui kolom.
Dalam kromatografi adsorbsi, komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom. Dalam
kromatografi partisi komponen yang dipisahkan secara selektif mengalami partisi antara lapisan cairan tipis pada penyangga padat yang bertindak sebagai fase stasioner dan eluen
yang bertindak sebagai fase gerak. Kromatografi pertukaran ion memisahkan komponen yang berbentuk ion. Komponen-komponen ion tersebut yang terikat pada penukar ion
sebagai fase stasioner secara selektif akan terlepas atau terelusi oleh fase gerak. Dalam kromatografi filtrasi gel, kolom diisi dengan gel yang permiabel sebagai fase stasioner.
Pemisahan berlangsung seperti proses pengayakan, yang didasarkan atas ukuran molekul dari komponen yang dipisahkan. Adnan,1997
Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi grafitasi atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi
dengan keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Ukuran keseluruhan kolom sungguh beragam, tetapi biasanya panjangnya sekurang- kurangnya
10 kali garis tengah dalamnya dan mungkin saja sampai 100 kali.
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau
bahkan tabung plastik. Pelarut fasa gerak dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong oleh tekanan. Pita senyawa linarut
bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom.
Ada empat perubahan utama yang dilakukan pada cara kolom klasik. Pertama dipakai penyerap yang lebih halus dengan kisaran ukuran mesh lebih sempit, agar tercipta
kesetimbangan yang lebih baik di dalam sistem. Kedua sistem tekanan biasanya pompa mekanis, dipakai untuk mendorong pelarut melalui penyerap yang halus. Ini perlu karena
ukuran partikel kecil, tetapi pompa itu juga menyebabkan kromatografi lebih cepat, jadi memperkecil difusi. Ketiga detektor telah dikembangkan sehingga diperoleh analisis
senyawa yang bersinambungan ketika senyawa itu keluar dari kolom. Data analisi ini dapat dipakai untuk membagi- bagi fraksi ketika keluar, dan jika diperlakukan dengan
tepat, dapat memberikan data kuantitatif mengenai banyaknya senyawa yang ada. Akhirnya penyerap baru dan cara pengemasan kolom baru dikembangkan sehingga
memungkinkan derajat daya pisah yang tinggi tercapai. Gritter, 1991 .
Pemilihan pertama dari pelarut untuk kromatografi kolom ialah bagaimana sifat kelarutannya. Tetapi lebih baik untuk memilih suatu pelarut bergantung pada kekuatan
elusinya sehingga zat – zat elusi yang lebih kuat dapat dicoba. Yang dimaksudkan dengan kekuatan elusi ialah daya penyerapan pada penyerap dalam kolom. Biasanya pada
penyerap – penyerap yang polar seperti alumina dan silika gel, maka kekuatan penyerapan baik dengan naiknya polaritas zat yang diserap. Menurut TRAPPE, kekuatan
elusi dari deret – deret pelarut untuk senyawa – senyawa elusi dalam kolom dengan menggunakan silika gel akan diturunkan dalam urutan sebagai berikut.
Air murni, methanol, etanol, propanol, aseton, etil asetat, dietil eter, kloroform, metilena klorida, benzene, toluene, trikloroetilena, karbon tetraklorida, sikloheksana,
heksana.Stahl,1990.
2.4. Teknik Spektroskopi
