kloroform 100 hingga bubur silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 18 g ekstrak kasar batang tumbuhan brotowali ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur
silika gel. Sampel dibiarkan turun dan terserap dengan baik pada silika gel dipuncak kolom, lalu ditambahkan fase gerak kloroform : etanol 4 : 1 vv secara perlahan –lahan
dan diatur sehingga liran fraksi yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Hasil yang diperoleh ditampung dalam beberapa botol
vial, lalu diuapkan diudara terbuka sampai pelarutnya habis hingga terbentuk kristal alkaloida.
3.3.6. Pemurnian Kristal Hasil Isolasi
Dari analisis taip – tiap fraksi dengan kromatografi lapisan tipis, diperoleh noda – noda dengan harga Rf yang hampir sama, ykni pada fraksi 15 – 30. lalu fraksi tesebut
digabungkan dan diuapkan, diperoleh larutan pekat berwarna Kuning kehijauan. Kemudian dicuci dengan pelarut etanol secara berulang – ulang sebanyak 3 kali,
kemudian dikeringkan hingga terbentuk kristal berwarna kuning berbentuk jarum sebanyak 1,38 g
3.3.7. Analisis Kristal Hasil Isolasi
3.3.7.1. Analisis Pada Kromatografi Lapis Tipis
1. Kristal yang diperoleh dari hasil rekristalisasi ditimbang sebanyak 15 mg lalu
dilarutkan dalam 10 ml etanol, lalu ditotolkan pada plat KLT
2. Larutan fasa gerak yaitu kloroform : etanol 4 : 1 vv dimasukkan kedalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan bantuan kertas saring. Plat yang telah
ditotolkan sampel dimasukkkan kedalam bejana kromatografi dan dielusi. 3. Plat dikeluarkan dari bejana kromatografi selanjutnya dikeringkan dan diamati
dibawah sinar lampu UV yang memberikan warna biru, yang menunjukkan adanya alkaloid harga Rf dapat dilihat pada tabel 2
3.3.7.2. Uji Reaksi Warna Terhadap Kristal Hasil Isolasi Dengan Pereaksi Alkaloida
Larutan kristal dari prosedur 3.3.7.1 dibagi dalam empat tabung reaksi : 1. Tabung I ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Mayer memberikan endapan berwarna
putih 2. Tabung II ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Wagner memberikan endapan
berwarna coklat. 3. Tabung III ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Bouchardat memberikan endapan
berwarna coklat. 4. Tabung IV ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Drangendorff memberikan endapan
berwarna jingga.
3.3.7.3. Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni diletakkan diatas plat melting point apparatus, dihidupkan alat dan diatur temperaturnya. Lalu diamati temperatur sampai kristal
melebur. Titik lebur kristal yang diperoleh 175 - 177 C.
3.3.74. Analisis Spektroskopi Kristal Hasil Isolasi
Analisis kristal hasil isolasi dengan alat spektrofotometer FT – IR dan spektrometer
1
H – NMR diperoleh dari Laboratorium Dasar Bersama FMIPA UNAIR Surabaya dengan menggunakan pelarut CDCl
3
larutan standar TMS
