Prescreen digunakan untuk mengetahui apakah suatu senyawa merupakan senyawa bioaktif. Uji ini harus memiliki kapasitas yang tinggi dengan biaya yang
rendah dan waktu yang cepat. Dalam screen test dipilih ekstrak untuk digunakan pada secondary test, sedangkan monitor test berguna sebagai panduan pada
pemisahan ekstrak pekat melalui isolasi ekstrak murni sebagai senyawa bioaktif. Uji ini harus cepat, murah, berkapasitas tinggi, dan mudah diperoleh. Secondary
test dilakukan untuk menguji ekstrak murni yang diperoleh pada beberapa model dan kondisi untuk memilih ekstrak yang akan dikembangkan sebagai obat pada
terapi antikanker. Uji ini berkapasitas rendah, lambat dan mahal. Prescreen test dilakukan untuk mendapatkan nilai LC
50
, yaitu konsentrasi yang dapat mematikan 50 hewan uji dalam waktu 24 jam. Uji yang paling sering dilakukan adalah uji
kematian larva udang BSLT= brine shrimp lethality test. Uji antikanker dapat dilakukan secara in vivo dan in vitro. Uji in-vivo
secara spesifik dapat dilakukan secara mekanik maupun seluler, untuk mencari kemampuan sitotoksik, antimitotik dan antimetastatik. Uji ini juga dapat
dilakukan dengan melihat interaksinya dengan DNA Suffnes dan Pezzuto 1991. Salah satu uji yang didasarkan pada interaksi dengan DNA adalah dengan cara
melihat kemampuan senyawa uji untuk menghambat topoisomerase I dan II yang digunakan pada replikasi DNA.
2.6 Topoisomerase dan Inhibitor Topoisomerase I
Topoisomerase adalah enzim yang mengatur perubahan topologi DNA yang dilakukan dengan cara meningkatkan atau menurunkan jumlah pilinan pada
heliks ganda. Terdapat dua jenis topoisomerase yaitu topoisomerase I yang membuat pilinan positif atau meningkatkan jumlah pilinan heliks, dan
topoisomerase II yang membuat pilinan negatif atau menurunkan pilinan heliks ganda Jusuf 2001. Lebih lanjut dijelaskan bahwa peningkatan atau penurunan
jumlah pilinan tersebut dilakukan topoisomerase dengan cara memotong rantai fosfodiester antara dua nukleutida dari salah satu heliks ganda. Hengstler et al.
2002 mengelompokkan enzim topoisomerase ke dalam dua klas utama yaitu topoisomerase I yang berperan pada pemotongan DNA utas tunggal dan
topoisomerase II yang memotong DNA utas ganda.
Enzim DNA topoisomerase topo I dan II adalah target molekuler dari beberapa zat antikanker yang potensial, dengan demikian inhibitor dari enzim ini
potensial untuk obat antikanker. Pertumbuhan tumor dapat dihambat dan dijinakkan ke tahap dorman melalui pemblokiran proses angiogenesisnya.
Angiogenesis adalah proses terbentuknya pembuluh darah baru dari pembuluh darah yang telah ada. Komponen antiangiogenesis mampu menurunkan laju
pertumbuhan tumorkanker. Dengan dihambatnya aktivitas enzim DNA topoisomerase oleh senyawa inhibitor, maka proses terjadinya ikatan antara enzim
dengan DNA sel kanker semakin lama. Hal ini menyebabkan terbentuknya Protein Linked DNA Breaks PLDB, akibatnya terjadi kerusakan DNA sel kanker
dan selanjutnya berpengaruh terhadap proses dalam sel khususnya proses replikasi, yang diakhiri dengan kematian sel kanker Hsiang 1989, Joseph 1989
diacu dalam Sukardiman et al. 2002. Enzim topoisomerase adalah enzim yang berperan dalam proses replikasi,
transkripsi dan rekombinasi DNA dan juga proses proliferasi dan diferensiasi sel normal dan sel kanker. Enzim ini merupakan target bahan bioaktif yang memiliki
aktivitas antikanker, karena dengan dihambatnya enzim DNA topoisomerase maka proses dalam sel akan terhenti dan akhirnya akan terjadi kematian sel
tersebut Andreas et al. 1995. Aplikasi untuk pencarian bahan-bahan aktif antikanker dari alam dapat
menggunakan molekul target enzim DNA Topoisomerase. Enzim tersebut digunakan sebagai molekul target, karena mempunyai fungsi cukup penting dalam
proses intraseluler dari sel kanker yang berperan dalam proses replikasi, transkripsi, rekombinasi DNA dan proses proliferasi dari sel kanker Pommier
1993. Dewasa ini telah banyak senyawa dari bahan alam yang telah diisolasi yang bersifat antikanker dan memiliki molekul target enzim DNA topoisomerase
antara lain camptothecin dari tanaman Camptotheca acuminata Famili Nyssaceae, andriamycin, doxorubicin, mitoxantron dan etoposide VP-16,
teniposide V-26 Gambar 4.
Gambar 4 Struktur beberapa topoisomerase poison Ammon dan Osheroff 1995.
Aktivitas inhibisi terhadap kerja dari enzim DNA topoisomerase sebagai target obat antikanker melalui dua mekanisme yaitu penghambatan katalitik
catalytic inhibitor dan poison cleavable complex. Perbedaan mekanisme keduanya ditunjukkan pada Gambar 5.
Gambar 5 Perbedaan antara inhibitor katalitik dan poison Topogen
2006.
INHIBITOR TOPOISOMERASE I INHIBITOR TOPOISOMERASE II
Pada Gambar 5 reaksi normal sekuen diagram tengah melibatkan pengikatan DNA diikuti oleh pembelahan DNA untai tunggal maupun ganda,
pelekatan kembali dan pelepasan enzim. Inhibitor diagram kiri memblokir tahap pengikatan awal atau dengan kata lain mengganggu kemampuan enzim untuk
menggunakan DNA dalam pembelahan. Dalam hal ini, tidak ada relaksasi DNA atau dekantanasi DNA hanya topo 2 ketika aktivitas katalitik diblok oleh obat.
Topo poison diagram kanan bekerja pada tahap pembelahan yang menstabilkan kompleks pembelahan dan menghambat tahap pelekatan kembali. Dengan kata
lain agen ini bertujuan “meracuni” reaksi melalui penstabilan pembelahan intermediet dan pemanjangan umur dari kompleks pembelahan normalnya sangat
pendek. Inhibisi dari kerja topoisomerase mungkin melibatkan penghambatan
“konvensional” dimana aktivitas enzim dihambat atau diperlambat. Sebagai contoh pengikatan inhibitor pada sisi aktif atau perubahan sifat pengikatan dari
enzim dengan substrat. Tipe penghambatan ini umumnya ditunjukkan sebagai aktivitas penghambatan katalitik relaksasi Webb dan Ebeler 2004.
2.7 Elektroforesis
