3.3.4 Karakterisasi ekstrak aktif inhibitor topoisomerase I
Tujuan karakterisasi adalah untuk mengetahui kelompok senyawa yang terdapat pada ekstrak aktif inhibitor topoisomerase I. Uji yang dilakukan adalah
Ninhidrin, Molish, Lieberman Burchard dan Bradford Bintang 1999. Sebanyak 0,1 g ekstrak dilarutkan dalam pelarut masing-masing. Ekstrak heksana
dilarutkan dalam 5 ml heksana, ekstrak etil asetat dilarutkan dalam 5 ml etil asetat dan ekstrak metanol dilarutkan dalam 5 ml metanol.
Uji Ninhidrin
Uji ninhidrin dilakukan untuk menentukan adanya asam amino bebas dalam suatu bahan. Ninhidrin bereaksi dengan gugus amino pada asam amino
bebas membentuk senyawa berwarna ungu, sedangkan dengan prolin dan hidroksiprolin ninhidrin berwarna kuning. Cara pengujian adalah sebagai berikut
: ekstrak kasar Kablang 1 ml dalam tabung reaksi ditambah larutan ninhidrin 1 satu ml, lalu dipanaskan dalam penangas air mendidih selama lima menit. Bila
terlihat warna ungu berarti positif. Uji ini dilakukan secara duplo.
Uji Molish
Uji ini adalah uji umum untuk menentukan adanya karbohidrat dalam suatu bahan. Karbohidrat akan dipecah oleh asam sulfat pekat menjadi gugus
furfural yang akan bereaksi dengan sulfonat alfa-naftol membentuk senyawa berwarna ungu. Pereaksi molish terdiri atas alfa-naftol 5 dalam etanol 95
yang selalu dibuat segar. Uji ini dilakukan secara duplo. Cara pengujiannya dalam 1 ml ekstrak dibubuhi 2 tetes pereaksi molish lalu ditambahkan 1 ml asam
sulfat pekat melalui dinding tabung secara hati-hati. Bila terbentuk lapisan berwarna ungu, berarti positif mengandung karbohidrat. Bila tidak ada
karbohidrat akan berwarna hijau.
Uji Lieberman Burchard
Uji ini adalah uji umum untuk menentukan adanya steroid dalam suatu bahan. Cara pengujiannya adalah ekstrak 1 ml ditambahkan 1 ml kloroform, 10
tetes asam asetat anhidrat dan 2 tetes asam sulfat pekat melewati dinding tabung secara berurutan. Campuran dikocok perlahan-lahan dan dibiarkan beberapa
menit. Bila terbentuk warna biru, berarti positif menunjukkan adanya steroid. Uji ini dikerjakan secara duplo.
Uji Bradford
Uji ini untuk mengetahui adanya protein dalam suatu bahan. Uji Bradford menggunakan pereaksi coomassie blue yang terdapat dalam reagen bradford.
Coomassie blue tersebut mengikat protein membentuk kompleks berwarna biru
.
Ekstrak 0,1 ml ditambah dengan 1 ml pereaksi Bradford. Tabung ditutup rapat dengan parafilm dan dikocok dengan cara membalikkan tabung perlahan-lahan
beberapa kali. Jika menghasilkan warna biru cerah berarti positif mengandung protein. Kemudian didiamkan selama lima menit atau paling lama satu jam. Bila
terbentuk warna biru, berarti positif mengandung protein.
Uji alkaloid
Uji ini untuk mengetahui adanya alkaloid dalam suatu bahan dengan menggunakan pereaksi logam berat. Pereaksi didasarkan pada kesanggupan
alkaloid untuk bergabung dengan logam yang memiliki berat atom tinggi seperti merkuri, bismut dan iod. Ion logam pada senyawa pereaksi cenderung berikatan
koordinasi dengan nitrogen ligan membentuk senyawa komplek yang menyebabkan terjadi perubahan warna dan terbentuknya endapan. Sebanyak 1 g
ekstrak dilarutkan dengan 10 ml kloroform dan beberapa tetes NH
4
OH kemudian disaring ke dalam tabung reaksi bertutup. Ekstrak kloroform dalam
tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H
2
SO
4
2 M dan lapisan asamnya bagian atas dipisahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan
pada papan uji spot plate dan ditambahkan pereaksi Dragendorf KBiI
4
, Meyer K
2
HgI
4
dan Wagner KII
2
yang akan menimbulkan endapan dengan warna berturut-turut merah jingga, putih dan coklat menunjukkan alkaloid positif.
Uji saponin
Sebanyak 1 g ekstrak ditambahkan dengan air secukupnya selanjutnya dipanaskan pada air menidih selama 5 menit. Selesai proses pemanasan larutan
didinginkan dan dikocok, jika timbul busa yang bertahan lebih dari 10 menit maka pada ekstrak menunjukkan adanya saponin.
Uji flavonoid dan hidrokuinon
Uji flavonoid dan fenolik hidrokuinon dilakukan dengan prosedur sebanyak 1 g contoh ditambah metanol 30 sampai terendam lalu dipanaskan. Selanjutnya
dilakukan penyaringan dan filtrat yang diperoleh ditaruh kedalam spot plate papan uji dan kemudian ditambahkan NaOH 10 bv atau H
2
SO
4
pekat. Terbentuknya warna merah akibat penambahan H
2
SO
4
menunjukkan adanya flavonoid dan fenolik hidrokuinon ditandai dengan terbentuknya warna merah
karena penambahan NaOH.
Uji triterpenoid dan steroid
Uji Liebermann Burchard dilakukan berdasarkan asetilasi 3 β hidroksi oleh
asam anhidrida dalam H
2
SO
4
. Ester asetil 3 β hidroksi sterol yang mengandung
ikatan ganda didalam asam akan mengalami epimerisasi menjadi bentuk 3 α dan
reaksi eliminasi yang menimbulkan produk berwarna. Uji triterpenoid ditandai dengan warna ungu atau merah, sedangkan steroid warna hijau atau biru.
Sebanyak 2 g ekstrak ditambah 25 ml etanol 30 dipanaskan 50
o
C dan disaring, filtratnya diuapkan kemudian ditambah eter. Lapisan eter dipipet dan
diujikan pada spot plate dengan menambahkan pereaksi Liebermen Burchard 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H
2
SO
4
pekat kemudian diamati warna yang terbentuk.
3.3.5 Isolasi senyawa target dengan metode spesifik
Kategori