Masing-masing filtrat yang dihasilkan dievaporasi dengan suhu yang sesuai dengan pelarut yang digunakan sampai terbentuk ekstrak yang berupa
pasta, selanjutnya ekstrak dari masing-masing pelarut disebut ekstrak heksana, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol. Masing-masing ekstrak dikerok dan
dimasukkan ke dalam botol sampel, kemudian disimpan pada suhu 4
°
C. Selanjutnya ketiga ekstrak tersebut dicuci untuk membersihkan ekstrak dari
pengotor dengan cara melarutkan dalam pelarut masing-masing dan didiamkan selama semalam di lemari es. Bagian yang terlarut dievaporasi untuk menguapkan
pelarutnya. Bila sudah tidak terbentuk endapan maka ekstrak disebut ekstrak bersih.
3.3.3 Uji aktivitas inhibitor topoisomerase I TopoGen 2006
Uji inhibisi enzim DNA topoisomerase dari ekstrak dan fraksi-fraksi dengan metode elektroforesis. Substrat yang digunakan adalah DNA plasmid
superkoil 25 μg dalam 100 μl buffer TAE tris base-glacial acetic acid-EDTA
yang terdiri dari 0,25 μgμl TE Tris HCl-EDTA : 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1
mM etilen diamin tetra asetat EDTA, kemudian ditambah 3 μl enzim DNA
topoisomerase I. Volume reaksi akhir menjadi 20
μl. Penambahan dilakukan secara berurutan, yang terakhir ditambahkan adalah enzim topoisomerase,
selanjutnya aquades ditambahkan untuk mencapai volume 20 μl.
Reaksi harus dilakukan dalam tabung mikrosentrifuse dalam es. Setelah penambahan enzim, tabung diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Pada akhir reaksi ditambahkan dengan 110 volume dari 10 sodium dodecyl sulfate
SDS, penambahan SDS pada suhu 37
o
C untuk menjebak enzim dalam kompleks pembelahan. Sisa enzim selanjutnya diinaktifkan dengan dengan
Proteinase-K atau pronase untuk menghancurkan protein dan diekstrak sekali lagi dengan chloroform isoamyl alcohol CIA terutama untuk mengisi gel. Hasil
inkubasi diencerkan dengan bufer dan dilanjutkan dengan analisis elektroforesis dengan gel agarosa. Selanjutnya dilakukan pewarnaan dengan etidium bromida,
untuk penentuan kualitatif bentuk DNA nick dan superkoil. Aktivitas inhibisi enzim topoisomerase I ditentukan dengan kemampuan enzim untuk merubah
bentuk DNA superkoil menjadi DNA bentuk nickrelaxed. Enzim DNA topoisomerase yang digunakan adalah human topoisomerase I dari Drug
Screening Kit topoGen. Kontrol positif inhibitor topoisomerase I adalah
Camptothecin . Selain untuk sampel disertakan juga reaksi yang berfungsi
sebagai kontrol Lampiran 6. Gambar 10 menunjukkan tahapan dalam uji aktivitas inhibitor topoisomerase I.
Gambar 10 Tahapan dalam uji inhibitor topoisomerase I.
Diinkubasi 37
o
C dalam heating block
atau water bath selama 30 menit
Ditambahkan 2µl 110 volume SDS 10
Ditambahkan 1 µl proteinase K dari stok 20 µgµl
Dinkubasi 37
o
C dalam heating block
atau water bath selama 30 menit
Ditambahkan 2 µl 110 volume loading buffer
Ditambahkan 20 µl volume yang sama kloroform:isoamil alkohol CIA24 : 1
Divortex dan disentrifugasi secukupnya
Lapisan atas berwarna biru, diambil, lalu dielektroforesis dalam
gel agarosa 1 Akuades secukupnya sampai volume 20 µl
10 x buffer TGS 2 µl DNA plasmid superkoil 250ngµl 1 µl
Kontrol inhibitor atau sampel jumlah bervariasi Enzim DNA topoisomerase I 2
μl terakhir
3.3.4 Karakterisasi ekstrak aktif inhibitor topoisomerase I
