Ekstraksi Imunoglobulin Y Ig Y dari Kuning Telur dengan Teknik Water Soluble Fraction WSF Preparasi Antigen Streptococcus sp. dan Staphylococcus aureus

3.4.2 Ekstraksi Imunoglobulin Y Ig Y dari Kuning Telur dengan Teknik Water Soluble Fraction WSF

Ekstraksi Ig Y dari kuning telur menggunakan teknik Water Soluble Fraction WSF yang dikembangkan oleh Akita dan Nakai 1993. Kuning telur dipisahkan dari putih telur, kemudian diletakkan diatas kertas saring untuk menghilangkan putih telur yang melekat. Membran kuning telur dilubangi dengan cara diangkat dengan pinset, cairan kuning telur ditampung pada gelas beker dan dilarutkan secara perlahan dalam milli-Q pH 4 dengan perbandingan 1 : 4. Setelah homogen ditambahkan lagi milli-Q hingga pH 2 suspensi 5.0 sampai 5.2 dan disimpun pada suhu 4 C minimal 12 jam. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 3125 g pada 4 C selama 20 menit dan supernatan diambil dan diperoleh water soluble fraction WSF. Selanjutnya WSF dibuat hingga pH 7.5. WSF dipekatkan dengan PEG 6.000 dan amonium sulfat. WSF ditambahkan PEG 6.000 sehingga konsentrasi akhir 12 wv. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 15 menit suhu 20 C. Pelet ditambahkan dengan amonium sulfat 40 sebanyak 5 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 11.700 g selama 15 menit, dilakukan 3 kali. Pelet disuspensikan dengan PBS sebanyak 1 ml, dan ditambahkan dua tetes 0.1 Na Azide. Suspensi didialisis selama 24 jam dengan PBS pH 8.0 Polson et al. 1980. Setelah di ekstraksi Ig dihitung konsentrasinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm.

3.4.3 Preparasi Antigen Streptococcus sp. dan Staphylococcus aureus

Isolat bakteri Streptococcus sp. dan S. aureus ditumbuhkan dalam 50 ml media BHI, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C. Setelah diinkubasi 18 sampai 24 jam masing-masing isolat disentrifus dengan kecepatan 1.0000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 5 ml NaCl fisiologis, kemudian disentrifus dengan kecepatan 1.0000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang lagi pencucian dilakukan dua kali. Pelet ditambah dengan 0,5 ml HCL 0,2 N, kemudian ditangas pada suhu 52 o C selama 1 jam. Satu tetes phenol red ditambahkan sebagai indikator. Suspensi disentrifus dengan kecepatan 1.0000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan digunakan sebagai antigen terlarut dan disimpan pada suhu 4 o C Wibawan et al. 2004.

3.4.4 Penentuan Konsentrasi Ig Y dengan Spektrofotometer