BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu
Tempat pengambilan contoh daun populasi Jati Rakyat Tectona grandis Linn. f. dilakukan di 3 populasi yaitu Jawa Barat-Banten Populasi 1, Jawa
Timur Populasi 2 dan Jawa Tengah Populasi 3 Tabel 1. Analisis ADN dilaksanakan di Ruang Analisis Genetika, Laboratorium Silvikultur, Fakultas
Kehutanan, Institut Pertanian Bogor yang dimulai dari Februari sampai Juli 2007.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Bahan tanaman
Bahan yang digunakan untuk penelitian adalah daun Jati dari hutan rakyat Tectona grandis Linn. f Gambar 5. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan
untuk proses ekstraksi ADN dari daun dan proses amplifikasi ADN dengan teknik RAPD disajikan pada Tabel 2.
Gambar 5 Daun Jati Tectona grandis Linn. f
Tabel 1 Lokasi pengambilan daun Jati Tectona grandis Linn. f dari hutan rakyat di 3 populasi di Pulau Jawa
No. Populasi
Kabupaten Jumlah
sampel
1 Jawa Barat-Banten Pop 1
- Bogor - Rangkasbitung
3 4
2 Jawa Timur Pop 2
- Ngawi - Bojonegoro
- Kebonharjo 4
4 4
3 Jawa Tengah Pop 3
- Cepu - Kendal
- Randublatung 3
3 4
Total 29 sampel
Tabel 2 Bahan-bahan Ekstraksi ADN dan RAPD
Bahan Ekstraksi ADN
RAPD
Tris-HCl 1M, NaCl 5 M, EDTA 0,5 M, CTAB 10, Merkapetanol, PVP 1, Aquades dan Fenol.
H
2
0, Gotaq green Master mix,
Primer, ADN.
3.2.2 Alat-alat penelitian
Alat-alat yang digunakan untuk penelitian ini terbagi dalam empat kegiatan yaitu kegiatan ekstraksi ADN, RAPD, analisis data dan alat-alat yang digunakan
secara umum selama penelitian. Gambar dan alat-alat yang digunakan selama kegiatan penelitian dapat dilihat pada Tabel 3 dan Gambar 6.
Tabel 3 Alat-alat Ekstraksi ADN, RAPD, analisis data dan umum
No Kegiatan
Alat yang digunakan
1 Ekstraksi
Pestel, mortar, vortex, pH meter, freezer, desikator, water bath
, dan tube 2ml. 2
RAPD Microtube 0,2 ml dan mesin PCR
3 Analisis Data
Komputer, softwere POPGEN32 dan NTSYS versi 2.0
4 Umum
Pipet, pipet mikro, tips, sentrifugasi, koleksi tabung, cetakan gel, bak elektroforesis, microwave,
power supply , gelas piala, gelas ukur, timbangan
analitik, pengaduk magnet, ultraviolet
transiluminator , dan kamera digital, dan sarung
tangan.
a b
c d
e f
g h
Gambar 6 Foto alat-alat penelitian, a. Mesin PCR, b. Unit elektroforesis, c. Mesin Water bath fisherbrand, d. Sentrifugasi, e. Mikropipet, f.
Microwave, g. Neraca, pH meter, h. Freezer
3.3 Metode Penelitian
Metode analisis ADN dengan RAPD dibagi menjadi tiga tahapan yaitu ekstraksi, RAPD dan analisis data. Secara umum prosedur penelitian dengan
metode RAPD dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7 Bagan Prosedur Penelitian
Ekstraksi DNA
Ya Tidak
PCR
Ya Tidak
RAPD
Analisis data
3.3.1 Ekstraksi ADN
Ekstraksi ADN pada daun Jati rakyat Tectona grandis Linn. f secara umum dilakukan dengan prosedur yang sama dengan kegiatan ekstraksi untuk
jenis-jenis pohon kehutanan yang lain. Bahan yang akan dianalisis berupa contoh daun Jati rakyat dengan ukuran 2 x 2 cm digerus dengan menggunakan nitrogen
cair di dalam pestel yang bersih sampai membentuk serbuk. Hasil gerusan dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml dan untuk mempercepat proses penghancuran
sel secara kimia ditambahkan 500-700 mikro liter larutan buffer ekstrak dan 100 mikro liter PVP 2, kemudian campuran tersebut divortex agar menjadi
homogen. Selain itu untuk mempercepat proses penghancuran sel secara thermal dilakukan proses inkubasi di dalam waterbath selama 45 menit – 1 jam pada suhu
65
o
C, campuran tersebut setiap 15 menit dibolak-balikan agar semua bahan di dalam tube terjadi proses penghancuran sel baik yang terdapat pada bagian atas
dan bawah tube. Setelah 45 menit – 1 jam diinkubasi, tube diangkat dan didinginkan selama 15 menit.
Untuk memisahkan antara cairan bahan kimia dengan cairan yang mengandung ADN supernatant ditambahkan Chloroform IAA 500 mikro liter
dan Fenol 10 mikro liter, kemudian dikocok dan tube disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Cairan yang mengandung ADN
supernatant dipindahkan ke dalam tube baru, kegiatan atau proses di atas dilakukan dua kali.
Untuk mendapatkan pellet ADN, ke dalam tube yang berisikan supernatant
ditambahkan isopropanol dingin 500 mikro liter dan NaCl 300 mikro liter dan disimpan di dalam freezer selama 45 menit-1 jam. Fase padat pellet
dicuci dengan etanol 100 sebanyak 300 mikro liter yang ditambahkan ke dalam tube
untuk memurnikan ADN dari sisa-sisa bahan kimia, proses tersebut dilakukan 2 kali, kemudian dikeringkan dalam desikator ± 15 menit. Larutan TE
sebanyak 20 mikro liter ditambahkan untuk mendapatkan pellet ADN yang pekat. Pengujian kualitas ADN dilakukan setelah pellet ADN larut secara
homogen. Untuk menguji kualitas ADN hasil ekstraksi dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar 1 bv. Gel
agarose merupakan campuran antara larutan TAE 1X dengan agarose.
Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan aliran listrik dengan tegangan 100 volt selama kurang lebih 30 menit yang pada prinsipnya dilakukan dengan
memigrasikan ADN dalam gel agarose pada tegangan tertentu dari arus - atau katoda ke arus + atau anoda. Secara visual, hasil elektroforesis dapat
menggambarkan tingkat keutuhan genom dan tingkat kontaminasi RNA dalam pellet
ADN terisolasi. Apabila kondisi hasil elektroforesis smear menunjukkan bahwa ADN yang diisolasi tidak utuh terbentuk potongan-potongan pendek atau
ADN yang diperoleh terkontaminasi oleh RNA. Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan dengan larutan Ethidium Bromide, selanjutnya pita ADN
hasil isolasi dilihat dengan menggunakan alat UV transilluminator. Hasil isolasi meliputi tebal tipis ADN dan ada tidaknya fragmen ADN ataupun RNA.
Komposisi bahan untuk ekstraksi yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Komposisi bahan untuk ekstraksi ADN
No Nama Bahan
1 Sampel reaksi X Sampel reaksi
1 Tris-HCl 1 M
100 mikro liter X x 100 mikro liter
2 NaCl 5 M
280 mikro liter X x 280 mikro liter
3 EDTA 0.5 M
40 mikro liter X x 40 mikro liter
4 CTAB 10
200 mikro liter X x 200 mikro liter
5 Merkapetanol
5 mikro liter X x 5 mikro liter
6 PVP 1
100 mikro liter X x 100 mikro liter
7 Aquades
280 mikro liter X x 280 mikro liter
3.3.2 Seleksi Primer
Primer adalah rantai pendek ADN yang dihasilkan secara buatan biasanya terdiri antara 10 – 25 nukleotida. Finkeldey 2005. Primer berfungsi sebagai titik
pemula terjadinya reaksi. Sepasang primer yang sekuennya telah ditentukan untuk dapat menemukan sekuen target pada ADN digunakan dalam PCR. Segmen ADN
diantara kedua titik pertemuan primer akan diamplifikasi dalam reaksi PCR. Primer berfungsi sebagai titik awal sintesis oleh enzim yang disebut DNA
polymerase yang diperoleh dari bakteri Thermus aquaticus. Enzim ini juga biasa
disebut Taq DNA polymerase. Enzim ini sesuai untuk proses amplifikasi karena
dapat bertahan pada suhu tinggi hingga 95
o
C meskipun suhu optimum bagi aktivitas enzim adalah 72
o
C. Setelah terjadi annealing selanjutnya dilakukan perbanyakan fragmen ADN melalui proses ekstensi pada suhu 72
o
C. Dalam teknik RAPD, umumnya primer yang digunakan berupa
oligonukleotida yang memiliki panjang sebesar 10-mer yang dipilih secara acak dan minimum memiliki lima basa G dan C. Primer yang mempunyai panjang
kurang dari 9-mer dapat digunakan, tetapi akan menghasilkan produk amplifikasi yang lebih sedikit dan diperlukan metode pewarnaan yang lebih sensitif untuk
mendeteksinya. Seleksi primer dimaksudkan untuk mencari primer acak yang
menghasilkan penanda polimorfik, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan produk amplifikasi primer positif dan dari primer positif tidak
semuanya menghasilkan fragmen ADN polimorfik. Pada kegiatan ini dilakukan survei terhadap 35 primer, yaitu primer dari golongan OPO dan OPY yang
diproduksi oleh Operon Technology. Primer dari golongan OPO yaitu dengan memiliki kode primer O.1, O.2,
O.4, O.5, O.6, O.7, O.8, O.9, O.10, O.11, O.12, O.13, O.14, O.15, O.16, O.18, O.19 dan O.20. Sedangkan primer dari golongan OPY memiliki kode primer Y.1,
Y.2, Y.3, Y.4, Y.5, Y.6, Y.8, Y.9, Y.11, Y.12, Y.13, Y.14, Y.15, Y.16, Y.17, Y.18 dan Y.20. Urutan basa nukleotida primer OPO dan OPY dapat dilihat pada
Tabel 5.
Tabel 5 Urutan basa nukleotida 35 primer Operon Technology
No. Primer Urutan Basa
No. Primer
Urutan Basa 1
OPO-01 5 GGCACGTAAG 3
1 OPY-01
5 GGTGGCATCT 3 2
OPO-02 5 ACGTAGCGTG 3
2 OPY-02
5 CATCGCCGCA 3 3
OPO-04 5 AAGTCCGCTC 3
3 OPY-03
5 ACAGCCTGCT 3 4
OPO-05 5 CCCAGTCACT 3
4 OPY-04
5 GGCTGCAATG 3 5
OPO-06 5 CCACGGGAAG 3
5 OPY-05
5 AGCCGTGGAA 3 6
OPO-07 5 CAGCACTGAC 3
6 OPY-06
5 AAGGCTCACC 3 7
OPO-08 CCTCCAGTGT 3
7 OPY-08
5 AGGCAGAGCA 3 8
OPO-09 5 TCCCACGCAA 3
8 OPY-09
5 GTGACCGAGT 3 9
OPO-10 5’ TCAGAGCGCC 3
9 OPY-11
5 AGACGATGGG 3 10 OPO-11
5 GACAGGAGGT 3 10
OPY-12 5 AAGCCTGCGA 3
11 OPO-12 5 CAGTGCTGTG 3
11 OPY-13
5 CACAGCGACA 3 12 OPO-13
5 GTCAGAGTCC 3 12
OPY-14 5 GGTCGATCTG 3
13 OPO-14 5 AGCATGGCTC 3
13 OPY-15
5 AGTCGCCCTT 3 14 OPO-15
5’ TGGCGTCCTT ‘3 14
OPY-16 5 GGGCCAATGT 3
15 OPO-16 5 TCGGCGGTTC 3
15 OPY-17
5 GACGTGGTGA 3 16 OPO-18
5 CTCGCTATCC 3 16
OPY-18 5 GTGGAGTCAG 3
17 OPO-19 5 GGTGCACGTT 3
17 OPY-20
5 AGCCGTGGAA 3 18 OPO-20
5 ACACACGCTG 3
3.3.3 PCR Polymerase Chain Reaction
Proses PCR membutuhkan 4 komponen utama yaitu H
2
O, Gotaq green master mix, primer dan cetakan ADN Tabel 6. Semua bahan tersebut dicampurkan ke dalam tube
0,2 ml. ADN hasil proses ekstraksi sebelum dilakukan proses amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran dengan menggunakan aquabidest. Besarnya perbandingan antara
ADN dengan aquabidest tergantung dari tebal dan tipisnya ADN genomik hasil ekstraksi. Tabel 6 Komposisi bahan untuk reaksi PCR
No Nama Bahan
1 Sampel reaksi X Sampel reaksi
1 H
2
O 2 mikro liter
X x 2 mikro liter 2
Gotaq green master mix 7,5 mikro liter
X x 7,5 mikro liter 3
Primer 1,5 mikro liter
X x 1,5 mikro liter 4
Cetakan ADN 2 mikro liter
X x 2 mikro liter
Dalam proses PCR untuk mengetahui kosentrasi ADN hasil ekstraksi dapat ditetapkan dengan melakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose.
Hasil dari proses PCR sangat ditentukan oleh primer yang digunakan. Proses PCR adalah suatu siklus berjangka pendek 30–60 detik dengan tiga perubahan suhu
yang berubah secara cepat Tabel 7. Tabel 7 Tahapan-tahapan dalam proses PCR untuk teknik RAPD
Tahapan Suhu
Waktu Jumlah Siklus
Pre-denaturation 95
C 2 menit
1 Denaturation
Annealing Extension
95 C
37 C
72 C
1 menit 2 menit
2 menit 45
Final Extension 72
C 5 menit
1 Proses PCR dilakukan dengan menggunakan primer hasil dari seleksi.
Hasil proses PCR kemudian dianalisis dengan melakukan elektroforesis menggunakan 2,0 gel agarose dalam larutan buffer 1 x TE dan distaining
didalam larutan Ethidium Bromide. Produk PCR dari individu pohon yang berbeda akan menghasilkan panjang sekuen yang berbeda pula. Perbedaan ini
akan dapat dideteksi dengan elektroforesis dengan gel agarose.
3.4 Analisis Data
Hasil PCR yang telah dielektroforesis difoto dan dianalisis dengan melakukan scoring pola pita yang muncul. Pola pita yang muncul positif diberi
nilai 1 dan pola pita yang tidak muncul negatif diberi nilai 0. Hasil perhitungan kemudian dianalisis untuk mengetahui frekuensi dan keragaman antar popinsi dan
antar populasi dengan menggunakan software POPGENE 32. Pendugaan hubungan kekerabatan dilakukan berdasarkan jumlah pita polimorfik yang
dimiliki bersama Nei dan Lei 1979 dalam Yunanto 2006, sedangkan pengelompokan kerabat berdasarkan metode UPGMA Unweighted Pair Group
with Arithmatic Average Nei 1973 dalam Yunanto 2006 dengan software
NTSYS Ver 2.0 Rohlf 1998. Proses scoring dapat dilihat pada Gambar 8.
Lokus Individu
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-1
L-2 L-3
L-4
Lokus Individu
1 2
3 4
5 6
7 8 9 10 11
L-1
1 1
1 1
1 1
1 1
L-2
1 1
1 1
1 1
1 1
1
L-3
1 1
1 1
1 1
L-4
1 1
1 1
1 1
1 1
1
Gambar 8 Cara penilaian pita dengan sistem scoring 1 = ada pita, 0 = tidak ada pita Yunanto, 2006
Selain menggunakan software, nilai variabilitas genetik yang dianalisis dapat dihitung secara manual. Rumus untuk perhitungan variabilitas genetik yang digunakan
dalam penelitian ini adalah sebagai berikut Finkeldey, 2005: 1. Persentase Lokus Polimorfik PLP = NLPNLP +NLM x 100
Keterangan : NLP : jumlah lokus polimorfik
NLM : jumlah lokus monomorfik 2. Jumlah alel yang diamati na = jumlah semua lokusjumlah lokus yang diamati
2. Jumlah alel yang efektif ne = 1 jumlah frekuensi alel p
2
3. Heterozigitas harapan H
e
= 1- jumlah frekuensi alel p
2
4. Diferensiasi genetik G
ST
= H
T
- H
S
H
T
Keterangan : H
T
: keragaman populasi total H
S
: keragaman populasi tunggal
80x
40x 20x
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Ekstraksi ADN dan PCR 4.1.1 Ekstraksi ADN