Ekstraksi ADN Metode Penelitian

3.3.1 Ekstraksi ADN

Ekstraksi ADN pada daun Jati rakyat Tectona grandis Linn. f secara umum dilakukan dengan prosedur yang sama dengan kegiatan ekstraksi untuk jenis-jenis pohon kehutanan yang lain. Bahan yang akan dianalisis berupa contoh daun Jati rakyat dengan ukuran 2 x 2 cm digerus dengan menggunakan nitrogen cair di dalam pestel yang bersih sampai membentuk serbuk. Hasil gerusan dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml dan untuk mempercepat proses penghancuran sel secara kimia ditambahkan 500-700 mikro liter larutan buffer ekstrak dan 100 mikro liter PVP 2, kemudian campuran tersebut divortex agar menjadi homogen. Selain itu untuk mempercepat proses penghancuran sel secara thermal dilakukan proses inkubasi di dalam waterbath selama 45 menit – 1 jam pada suhu 65 o C, campuran tersebut setiap 15 menit dibolak-balikan agar semua bahan di dalam tube terjadi proses penghancuran sel baik yang terdapat pada bagian atas dan bawah tube. Setelah 45 menit – 1 jam diinkubasi, tube diangkat dan didinginkan selama 15 menit. Untuk memisahkan antara cairan bahan kimia dengan cairan yang mengandung ADN supernatant ditambahkan Chloroform IAA 500 mikro liter dan Fenol 10 mikro liter, kemudian dikocok dan tube disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Cairan yang mengandung ADN supernatant dipindahkan ke dalam tube baru, kegiatan atau proses di atas dilakukan dua kali. Untuk mendapatkan pellet ADN, ke dalam tube yang berisikan supernatant ditambahkan isopropanol dingin 500 mikro liter dan NaCl 300 mikro liter dan disimpan di dalam freezer selama 45 menit-1 jam. Fase padat pellet dicuci dengan etanol 100 sebanyak 300 mikro liter yang ditambahkan ke dalam tube untuk memurnikan ADN dari sisa-sisa bahan kimia, proses tersebut dilakukan 2 kali, kemudian dikeringkan dalam desikator ± 15 menit. Larutan TE sebanyak 20 mikro liter ditambahkan untuk mendapatkan pellet ADN yang pekat. Pengujian kualitas ADN dilakukan setelah pellet ADN larut secara homogen. Untuk menguji kualitas ADN hasil ekstraksi dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar 1 bv. Gel agarose merupakan campuran antara larutan TAE 1X dengan agarose. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan aliran listrik dengan tegangan 100 volt selama kurang lebih 30 menit yang pada prinsipnya dilakukan dengan memigrasikan ADN dalam gel agarose pada tegangan tertentu dari arus - atau katoda ke arus + atau anoda. Secara visual, hasil elektroforesis dapat menggambarkan tingkat keutuhan genom dan tingkat kontaminasi RNA dalam pellet ADN terisolasi. Apabila kondisi hasil elektroforesis smear menunjukkan bahwa ADN yang diisolasi tidak utuh terbentuk potongan-potongan pendek atau ADN yang diperoleh terkontaminasi oleh RNA. Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan dengan larutan Ethidium Bromide, selanjutnya pita ADN hasil isolasi dilihat dengan menggunakan alat UV transilluminator. Hasil isolasi meliputi tebal tipis ADN dan ada tidaknya fragmen ADN ataupun RNA. Komposisi bahan untuk ekstraksi yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Komposisi bahan untuk ekstraksi ADN No Nama Bahan 1 Sampel reaksi X Sampel reaksi 1 Tris-HCl 1 M 100 mikro liter X x 100 mikro liter 2 NaCl 5 M 280 mikro liter X x 280 mikro liter 3 EDTA 0.5 M 40 mikro liter X x 40 mikro liter 4 CTAB 10 200 mikro liter X x 200 mikro liter 5 Merkapetanol 5 mikro liter X x 5 mikro liter 6 PVP 1 100 mikro liter X x 100 mikro liter 7 Aquades 280 mikro liter X x 280 mikro liter

3.3.2 Seleksi Primer