bumi, gas alam, dan uap panas bumi dan dapat digunakan pada minyak kelapa sawit, industri kimia farmasi Soedjoko, 1987.
Jenis kalsium – magnesium pada industri penyaringan lilin, minyak kelapa, industri besi baja yaitu sebagai perekat pasir cetak dalam proses pengecoran baja, industri
kimia sebagai katalisator, zat pemutih, zat penyerap, pengisi, lateks dan tinta cetak Soedjoko, 1987.
Berdasarkan hasil uji laboratorium, analisa terhadap contoh bentonit yang diambil langsung di lapangan, maka diperoleh komposisi bentonit adalah Kalsium
oksida CaO 0,23 , Magnesium Oksida MgO 0.98 , Alumunium Oksida Al
2
O
3
13,45 , Ferri Oksida Fe
2
O
3
2,18 , Slika SiO
2
74,9 , K
2
O 1,72 g. H
2
O 4 Proyek Kerja Dinas Pertambangan Sumatera Utara, 19992000.
Pemakaian bentonit terutama untuk kebutuhan industri perminyakan sebagai lumpur pemboran dan industri makanan ternak dan pupuk, semakin besar luas permukaannya
maka makin besar pula zat – zat yang terbawa atau melekat pada bentonit. Sehingga sifat ini dimanfaatkan sebagai bahan pembawa Carrier Soedjoko, 1987.
Selain bahan pembawa utama, biasanya juga ditambahkan beberapa bahan lain, misalnya kapur dan lempung yang fungsinya antara lain untuk megatur pH-nya
supaya sesuai dengan pH yang dibutuhkan oleh Rhizobia serta untuk memperoleh tekstur bahan inokulan yang baik , mudah dikemas dan digunakan Yuwono. T, 2006.
2.10. Aktivitas air A
w
Aktivitas air adalah kebutuhan air untuk pertumbuhan mikroorganisme atau aktivitas kimia air. Bakteri termasuk jenis bakteri yang tumbuh dengan cepat apabila keadaan
sekitarnya memungkinkan. Masing – masing jenis mikroorganisme membutuhkan jumlah air yang berbeda untuk pertumbuhannya. Kebanyakan bakteri nonhalofilik
mempunyai tingkat pertumbuhan maksimum pada kisaran nilai A
w
0,980 - 0,997, bakteri halofilik masih dapat tumbuh pada nilai A
w
Organisme 0,750. Aktivitas air minimal
beberapa jenis mikroorganisme tertentu: A
w
minimal Sebagian besar bakteri
0,90 Sebagian besar khamir
0,88
Universitas Sumatera Utara
Sebgaian besar jamur 0,80
Khamir Osmofilik 0,60
Purnomo ,H. 1995.
BAB 3
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1. Bahan-bahan
1. Bintil akar putri malu 2. Media Yeast Ekstrak Manitol Agar YEMA steril
3. Bentonit 4. Akuades
5. Akuades steril 6. Larutan Klorok
7. Congo Red p.a.E.Merck
8. Safranin p.a.E.Merck
9. Iodine 10. Kristal Violet
p.a.E.Merck p.a.E.Merck
11. Aseton alkohol p.a.E.Merck
12. Alkohol 96 Teknis
3.2. Alat-alat
1. Cawan Petri Pyrex
2. Tabung reaksi Pyrex
3. Pipet volume Pyrex
4. Labu Takar Pyrex
5. Gelas ukur Pyrex
6. Gelas Beaker Pyrex
7. Gelas Erlenmeyer Pyrex
8. Hot plate Thermoline
Universitas Sumatera Utara
9. Oven Gallenkamp
10. Autoclave Webeco
11. Incubator Fischer scientific
12. Mikroskop Prior England
13. Neraca analitik Ohaus
14. Water bath Griffin
15. Shaker Julabo SW 22
16. Bunsen 17. Jarum ose
18. Gelas objek dan Cover 19. Spatula
20. Pipet Tetes 21. Batang Pengaduk
22. Plastik tahan panas 23. Alumunium foil
24. Hockey Stick
3.3. Prosedur 3.3.1 Pengambilan Sampel
Sampel yang digunakan adalah Rhizobium dari tanaman Putri malu, yang memiliki bintil akar. Putri malu diambil dari lapangan terbuka. Pengambilan sampel dilakukan
dengan mencabut putri malu yang akarnya berbintil lalu dikumpulkan. Putri malu yang diperoleh dibawa ke laboratorium Biokimia FMIPA USU.
3.3.2. Isolasi Rhizobium dari bintil akar
Sampel yang telah dibawa ke laboratorium, kemudian diproses. Bintil akar dipilih dari tanaman putri malu yang tersedia kemudian bintil – bintil akar disterilkan dengan
merendam ke dalam tabung reaksi berisi akuades selama 2 menit, kemudian disaring. Sterilisasi dilanjutkan dengan menyemprot dengan alkohol 96 selama 10 detik dan
dibilas dengan akuades selama 2 menit. Lalu disemprot dengan larutan klorok selama
Universitas Sumatera Utara
10 detik dan dibilas dengan akuades selama 2 menit. Kemudian bintil akar yang steril tersebut digiling.
3.3.2.1. Identifikasi Rhizobium dengan Congo Red
Diambil kembali 1 - 2 ose dari suspensi yang sebelumnya telah diperoleh kemudian
digoreskan pada medium YEMA steril + congo Red yang telah disiapkan. Lalu diinkubasikan pada suhu 37
C selama 24 – 48 jam. Sehingga dipastikan bakteri yang tumbuh semua berwarna putih. Pertumbuhan Rhizobium diamati dengan
memperhatikan bentuk dan sifat – sifatnya. Pada umumnya koloninya putih transparan, flat dan sedikit berlendir
3.3.3. Pembuatan Pembiakan Murni
Bakteri yang diperoleh ditumbuhkan kembali pada medium YEMA steril dengan menggunakan metode garis sinambung, lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 – 48 jam. Tujuannya yaitu untuk memperoleh biakan murni dari bakteri Rhizobium.
3.3.3.1. Pengidentifikasian Bakteri
Plat kacagelas objek disterilkan terlebih dahulu dengan alkohol. Kemudian diambil satu ose biakan murni dari media diletakkan di atas plat kaca. Diteteskan akuades
sebanyak 2 tetes lalu difiksasi sampai kering. Plat kaca kemudian ditetesi dengan larutan kristal violet dan diamkan selama ± 30 detik, lalu dicuci dengan akuades.
Ditetesi kembali dengan larutan iodin dan didiamkan selama ± 30 detik, lalu dicuci dengan akuades. Kemudian ditetesi dengan larutan aseton alkohol dan didiamkan
selama 30 ± detik, dicuci dengan akuades. Lalu ditetesi kembali dengan larutan safranin dan diamkan selama ± 30 detik, dicuci dengan akuades. Dibiarkan mengering
lalu diamati di bawah mikroskop.
3.3.4. Pembuatan Starter Kultur
Universitas Sumatera Utara
Biakan murni Rhizobium yang ditumbuhkan kembali pada YEMA steril kemudian diambil 1 sampai 2 ose dan dicampur dengan 100 ml Yeast Manitol Broth YMB
dalam tabung erlenmeyer dikocok dengan alat penggojok Shaker selama 9 hari hingga diperoleh starter kultur.
3.3.5. Pencampuran Starter Dengan Medium Pembawa
Bentonit sebagai medium pembawa sebelumnya harus disterilkan terlebih dahulu. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121
C dan pada tekanan 15 psi selama 2 x 30 menit. Medium yang sudah disterilisasi dibagi dalam suatu wadah plastik dengan pembagian:
1. Wadah I : 5 g bentonit ditambahkan dengan 10 ml starter
2. Wadah II : 5 g bentonit ditambahkan dengan 15 ml starter
3. Wadah III : 5 g bentonit ditambahkan dengan 20 ml starter 4. Wadah IV : 5 g bentonit ditambahkan dengan 25 ml starter
5. Wadah V : 5 g bentonit ditambahkan dengan 30 ml starter
Sehingga memiliki perbandingan 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Kemudian dicampur sampai merata kedalam media pembawa dan diletakkan pada suhu kamar atau 27
C.
3.3.6. Pengujian Jumlah Sel dari Media Pembawa
Masing – masing wadah dengan perbandingan 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 ditimbang
sebanyak 1 g dan dimasukkan dalam tabung reaksi yang berbeda, kemudian ditambahkan dengan 10 ml akuadest steril. Dikocok sampai homogen dengan
menggunakan vortex lalu didiamkan selama 30 detik sampai 1 menit atau sampai partikel tanah mengendap. Dipipet sebanyak 1ml dengan menggunakan pipet volume
kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu divortex pengenceran 10
-2
. Dilakukan hal yang sama sampai pengenceran 10
-9
. suspensi diambil sebanyak 0,25 ml dan disebarkan pada medium YEMA + Congo Red dalam cawan Petri dengan
menggunakan metode cawan sebar. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 -
48 jam. Isolasi Rhizobium dari media pembawa dilakukan dari minggu 1 sampai minggu ke 5.
3.3.7. Pengujian Lapangan
Universitas Sumatera Utara
Pupuk hayati yang diperoleh kemudian diaplikasikan dalam bentuk tabur ke dalam masing-masing pot tanaman kacang hijau . Diukur lebar daun, Panjang Daun dan luas
daun dari minggu 1 sampai minggu ke 4.
3.3.8. Penentuan Aktivitas air A
w
pupuk hayati
Ditimbang sampel yaitu bahan pembawa bentonit dan starter kultur dengan variasi konsentrasi yang berbeda 1:2, 5 g bentonit ditambahkan dengan 10 ml starter 1:3,
1:4, 1:5, 1:6 kedalam gelas beaker yang sudah diketahui beratnya terlebih dahulu, kemudian dimasukkan dalam oven pada sampai airnya menguap, kemudian
dikeluarkan dan didinginkan sampai beratnya konstan, kemudian ditimbang kembali dan dihitung kadar A
w .
Purnomo, H. 1995.
Universitas Sumatera Utara
Disaring Dibilas dengan akuades steril selama 2 menit
Dibilas dengan akuades steril selama 2 menit
Diinokulasi 1 - 2 ose pada media YEMA + Congo Red pada cawan petri
Diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24-48 jam Koloni berwarna putih
Rhizobium Koloni berwarna merah
Agrobakterium Uji mikroskopis
Starter kultur Diinokulasi pada media Yeast Manitol Broth YMB lalu dishaker pada
temperatur kamar selama 9 hari
Didapat perbandingan 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 Suspensi bintil akar tanaman
putri malu
Biakan Murni Rhizobium Dicuci dengan akuades steril
Disemprot dengan alkohol 96 selama 10 detik
Bentonit ditimbang sebanyak 30 g Disterilkan di dalam autoclave pada suhu 121
C dan tekanan 15 psi selama 2x30 menit Ditimbang sebanyak 5 g bentonit kedalam 5 wadah yang berbeda
Bintil akar tanaman putri malu
Disemprot dengan larutan klorok selama 10 detik
3.4 Bagan penelitian 3.4.1. Bagan Penelitian Isolasi Bakteri Rhizobium Metode Dubey, 2006
3.4.1.1 Isolasi
Rhizobium dari akar tanaman Putri malu
Wadah I 5g bentonit +
10 ml starter Digiling
Ditanam ulang untuk mendapatkan biakan murni
Bentonit steril
Wadah II 5 g bentonit +
15 ml starter Wadah III
5 g bentonit + 20 ml starter
Wadah IV 5 g bentonit +
25 ml starter Wadah V
5g bentonit + 30 ml starter
Diinokulasikan selama 5 minggu pada suhu kamar Hasil
Universitas Sumatera Utara
Dimasukkan kedalam masing-masing 5 tabung reaksi Ditambahkan 10 ml akuades steril
Filtrat Rhizobium Endapan bentonit
Dipipet sebanyak 1 ml
Filtrat Diambil sebanyak 0,25 ml
Dihitung jumlah sel pada media pembawa dari minggu 1 sampai minggu ke 5 Suspensi Rhizobium
Ditimbang sebanyak 1 g
Didiamkan selama 1 menit
Dimasukkan kedalam tabung reaksi Dilakukan pengenceran 10
-2
– 10
-9
dengan cara divorteks
Disebarkan pada media YEMA + Congo Red dalam cawan petri Rhizobium pada bentonit
Dihomogenkan dengan vorteks
Wadah I 1 : 2
Hasil
Wadah II 1 : 3
Wadah III 1 : 4
Wadah IV 1 : 5
Wadah V 1 : 5
3.4.1.2.Perhitungan Jumlah Sel Pada Bahan Pembawa Carrier
3.4.1.3. Uji Aplikasi lapangan
Pupuk Hayati
Diukur panjang daun, lebar daun dan luas daun Selama 4 minggu
Tanaman Kacang Hijau
Hasil Diaplikasikan pada tanaman kacang hijau
dalam bentuk tabur
Dicatat hasil pengamatan
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian