10 detik dan dibilas dengan akuades selama 2 menit. Kemudian bintil akar yang steril tersebut digiling.
3.3.2.1. Identifikasi Rhizobium dengan Congo Red
Diambil kembali 1 - 2 ose dari suspensi yang sebelumnya telah diperoleh kemudian
digoreskan pada medium YEMA steril + congo Red yang telah disiapkan. Lalu diinkubasikan pada suhu 37
C selama 24 – 48 jam. Sehingga dipastikan bakteri yang tumbuh semua berwarna putih. Pertumbuhan Rhizobium diamati dengan
memperhatikan bentuk dan sifat – sifatnya. Pada umumnya koloninya putih transparan, flat dan sedikit berlendir
3.3.3. Pembuatan Pembiakan Murni
Bakteri yang diperoleh ditumbuhkan kembali pada medium YEMA steril dengan menggunakan metode garis sinambung, lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 – 48 jam. Tujuannya yaitu untuk memperoleh biakan murni dari bakteri Rhizobium.
3.3.3.1. Pengidentifikasian Bakteri
Plat kacagelas objek disterilkan terlebih dahulu dengan alkohol. Kemudian diambil satu ose biakan murni dari media diletakkan di atas plat kaca. Diteteskan akuades
sebanyak 2 tetes lalu difiksasi sampai kering. Plat kaca kemudian ditetesi dengan larutan kristal violet dan diamkan selama ± 30 detik, lalu dicuci dengan akuades.
Ditetesi kembali dengan larutan iodin dan didiamkan selama ± 30 detik, lalu dicuci dengan akuades. Kemudian ditetesi dengan larutan aseton alkohol dan didiamkan
selama 30 ± detik, dicuci dengan akuades. Lalu ditetesi kembali dengan larutan safranin dan diamkan selama ± 30 detik, dicuci dengan akuades. Dibiarkan mengering
lalu diamati di bawah mikroskop.
3.3.4. Pembuatan Starter Kultur
Universitas Sumatera Utara
Biakan murni Rhizobium yang ditumbuhkan kembali pada YEMA steril kemudian diambil 1 sampai 2 ose dan dicampur dengan 100 ml Yeast Manitol Broth YMB
dalam tabung erlenmeyer dikocok dengan alat penggojok Shaker selama 9 hari hingga diperoleh starter kultur.
3.3.5. Pencampuran Starter Dengan Medium Pembawa
Bentonit sebagai medium pembawa sebelumnya harus disterilkan terlebih dahulu. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121
C dan pada tekanan 15 psi selama 2 x 30 menit. Medium yang sudah disterilisasi dibagi dalam suatu wadah plastik dengan pembagian:
1. Wadah I : 5 g bentonit ditambahkan dengan 10 ml starter
2. Wadah II : 5 g bentonit ditambahkan dengan 15 ml starter
3. Wadah III : 5 g bentonit ditambahkan dengan 20 ml starter 4. Wadah IV : 5 g bentonit ditambahkan dengan 25 ml starter
5. Wadah V : 5 g bentonit ditambahkan dengan 30 ml starter
Sehingga memiliki perbandingan 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Kemudian dicampur sampai merata kedalam media pembawa dan diletakkan pada suhu kamar atau 27
C.
3.3.6. Pengujian Jumlah Sel dari Media Pembawa
Masing – masing wadah dengan perbandingan 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 ditimbang
sebanyak 1 g dan dimasukkan dalam tabung reaksi yang berbeda, kemudian ditambahkan dengan 10 ml akuadest steril. Dikocok sampai homogen dengan
menggunakan vortex lalu didiamkan selama 30 detik sampai 1 menit atau sampai partikel tanah mengendap. Dipipet sebanyak 1ml dengan menggunakan pipet volume
kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu divortex pengenceran 10
-2
. Dilakukan hal yang sama sampai pengenceran 10
-9
. suspensi diambil sebanyak 0,25 ml dan disebarkan pada medium YEMA + Congo Red dalam cawan Petri dengan
menggunakan metode cawan sebar. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 -
48 jam. Isolasi Rhizobium dari media pembawa dilakukan dari minggu 1 sampai minggu ke 5.
3.3.7. Pengujian Lapangan
Universitas Sumatera Utara
Pupuk hayati yang diperoleh kemudian diaplikasikan dalam bentuk tabur ke dalam masing-masing pot tanaman kacang hijau . Diukur lebar daun, Panjang Daun dan luas
daun dari minggu 1 sampai minggu ke 4.
3.3.8. Penentuan Aktivitas air A
