2. Bahan dan Alat 3. Metode 3. 1. Tahapan Penelitian

15

III. METODOLOGI PENELITIAN

III. 1. Tempat dan Waktu

Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Tanah Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, Laboratorium Bakterologi Fakultas Kedokteran Hewan, dan Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Lingkungan, Pusat Penelitian Lingkungan Hidup PPLH, Kampus Darmaga, IPB. Analisis pH dan sulfat SO 4 2- dilakukan di Laboratorium Kimia dan Kesuburan Tanah, Fakultas Pertanian, IPB. Penelitian dilakukan selama 6 bulan, dari bulan Maret 2005 sampai bulan September 2005.

III. 2. Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sludge bubur kayu yang berasal dari salah satu industri kertas di Riau, tanah bekas tambang batubara, media isolasi ya ng terdiri dari Nutrient Agar NA untuk total mikrob, Carboxy Methyl Cellulose CMC untuk mikrob selulolitik Anas, 1989, berdasarkan metode Nakamura et al. 1993 untuk bakteri pendegradasi xilan, dan Postgate B yang ditambah dengan agar untuk media bakteri pereduksi sulfat Clesceri et al., 1998, larutan garam fisiologis 0.85, kit anaerob, aquades, serta alkohol 95. Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk analisis sifat kimia yaitu NH 4 OAc, gelatin, dan HCl. Komposisi media dapat dilihat pada lampiran. Alat yang digunakan meliputi autoklaf, oven, laminar flow cabinet, inkubator, jar anaerob, pH meter, spektrofotometer, neraca analitik, shaker, spatula, pembakar bunsen, botol semprot, pipet, kertas saring dan peralatan gelas 16 seperti gelas piala, gelas ukur, labu takar, tabung reaksi, tabung ulir, cawan petri dan erlenmeyer. III. 3. Metode III. 3. 1. Tahapan Penelitian Tahapan penelitian ini Gambar 3 terdiri dari a. Isolasi mikrob Pembuatan seri pengenceran dan media. Seri pengenceran dibuat menggunakan larutan fisiologis NaCl 0.85, yaitu larutan yang berfungsi sebagai penyeimbang antara tekanan sel mikrob dengan tekanan luar larutan Anas, 1989. Cara pembuatannya dengan melarutkan 8.5 g NaCl dalam 1 liter air, kemudian dituang sebanyak 90 ml ke dalam erlenmeyer dan dipipet sebanyak 9 ml ke tabung reaksi, lalu diautoklaf pada suhu 121 C selama 30 menit. Seri pengenceran sebesar 10 -4 sampai 10 -6 digunakan dalam penghitungan total mikrob, mikrob selulolitik, dan bakteri pendegradasi xilan. Seri pengenceran tersebut dipilih karena berdasarkan percobaan pendahuluan seri pengenceran tersebut merupakan yang terbaik dalam perhitungan populasi mikrob. Cara membuat seri pengenceran 10 -1 adalah dengan melarutkan 10 gram sludge bubur kayu ke dalam 90 ml larutan fisiologis kemudian digoyang. Selanjutnya dari seri pengenceran 10 -1 , larutan dipipet 1 ml dan dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan fisiologis. Setelah itu dihomogenkan menggunakan vortex, didapatkan seri pengenceran 10 -2 , dan seterusnya cara ini dilakukan sampai didapat seri pengenceran 10 -6 . Media dibuat dengan mencampur komposisi yang ada dengan ukuran dan prosedur yang telah ditentukan, lalu 17 masing-masing media disterilkan menggunakan autoklaf selama 30 menit pada suhu 121 C. Isolasi. Setelah media dan seri pengenceran siap untuk digunakan, maka isolasi dilakukan menggunakan metode cawan tuang. Langkah awal yang dilakukan dalam isolasi menggunakan metode cawan tuang adalah suspensi yang paling encer atau seri pengenceran tertinggi 10 -6 dipipet 1 ml ke dalam cawan yang steril. Media yang sudah diautoklaf, didinginkan terlebih dahulu sampai temperatur media mencapai 40 C - 45 C hangat pada telapak tangan, kemudian dituang sebanyak 10 – 15 ml ke cawan petri yang telah berisi 1 ml suspensi sludge bubur kayu. Agar dapat tersebar merata pada cawan, maka media diputar ke arah kanan 3x dan ke kiri 3x. Hal ini juga dilakukan berurutan pada seri pengenceran yang lain, mulai dari seri pengenceran tinggi ke rendah 10 -6 sampai 10 -4 . Biakan diinkubasi pada suhu ruang sampai 1 minggu Tortora et al., 1986. Isolasi bakteri pereduksi sulfat. Sifat bakteri pereduksi sulfat yang anaerob, memunculkan dugaan bahwa populasi bakteri ini tidak sebanyak mikrob yang lain. Seri pengenceran yang digunakan dalam mengisolasi bakteri ini adalah 10 -1 sampai 10 -3 , sementara prosedur pembuatan media dan isolasi bakteri pereduksi sulfat sama dengan mikrob yang lain. Perbedaannya terletak pada penyimpanan biakan bakteri pereduksi sulfat yaitu dengan mengguna kan anaerob jar Gambar 2. Suhu dan waktu inkubasi tidak berpengaruh pada pertumbuhan biakan bakteri pereduksi sulfat. Dengan menggunakan kit anaerob yang berisi natrium bikarbonat dan natrium borohidrat yang telah dibasuhi dengan beberapa mililiter aquades, maka kondisi jar akan menjadi anaerob. 18 Proses yang awalnya terjadi di dalam jar adalah reaksi kimia antara kit anaerob dengan air menghasilkan hidrogen dan karbondioksida. Selanjutnya, katalis yang terdapat di dalam jar, mengkombinasikan antara oksigen yang terdapat di dalam jar dengan hidrogen hasil reaksi sehingga terbentuk air. Sebagai hasil, oksigen menghilang dengan cepat dan karbondioksida yang mengisi jar dapat mendukung mikrob anaerob untuk tumbuh Tortora et al., 1986. Gambar 2. a Jar anaerob Tortora et al., 1986, b Jar anaerob yang digunakan dalam penelitian b. Kajian perubahan nilai pH dan konsentrasi sulfat pada campuran tanah bekas tambang batubara dan sludge bubur kayu Kajian ini dilakukan untuk melihat pengaruh penambahan sludge pada tanah bekas tambang batubara terkait dengan mikrob yang tumbuh di dalamnya. Tanah bekas tambang batubara yang digunakan perlu disterilisasi untuk menghilangkan pengaruh mikrob tempatan indigenous. Sterilisasi dilakukan menggunakan fumigan dan tanah diinkubasi selama 10 hari. Tanah yang Cawan petri Indikator anaerob Kit anaerob Katalis a b 19 sebelumnya ditutup rapat, selanjutnya dibuka agar gas yang timbul akibat proses fumigasi dapat keluar. Langkah awal dalam pengukuran ini adalah mencampurkan tanah bekas tambang batubara yang sudah disterilkan dan sludge bubur kayu dengan perbandingan 3:1 bb. Selanjutnya campuran tanah dan sludge tersebut dimasukkan ke dalam tabung ulir sebanyak ¾ tabung dan digenangi dengan medium Postgate B. Untuk mendukung kondisi reduktif, paku perlu ditambahkan agar dapat mengikat oksigen yang kemungkinan masih tersisa di dalam tabung. Inkubasi dilakukan selama 20 hari.

III. 3. 2. Pengamatan dan Pengukuran