BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat-alat
Adapun alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, blender National, eksikator, hairdryer Fransen, krus
porselin, lampu UV 366 nm Diamond, mikroskop Olympus, neraca listrik Vibra AJ, neraca kasar, oven Memmert, penangas air Yenaco, penguap
vakum putar Haake D1 Fisons, seperangkat alat KLT, seperangkat alat penentuan kadar air, spektrofotometer inframerah IRPrestige21 Shimadzu,
spektrofotometer ultraviolet UV1800 Shimadzu dan tanur.
3.2 Bahan-bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah umbi bawang sabrang Eleutherinae bulbus. Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan
lain berkualitas proanalisis, yaitu amonium hidroksida, asam asetat anhidrid, asam klorida, asam sulfat, benzen, bismut III nitrat, etanol, eter, eter minyak tanah,
etilasetat, besi III klorida, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, n-heksan, natrium hidroksida, natrium sulfat anhidrat, raksa
II klorida, serbuk Mg, serbuk Zn, timbal II asetat, toluen, α-naftol. Plat
pralapis silika gel GF
254
, silika gel GF
254
dan air suling.
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan 3.3.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan
Bahan tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah umbi bawang sabrang Eleutherinae bulbus, yang diambil dari Jalan Bunga Rampe V,
Universitas Sumatera Utara
Kelurahan Simalingkar B, Kecamatan Medan Tuntungan, Medan, Sumatera Utara. Bagian tumbuhan yang digunakan adalah umbi segar yang berwarna
merah. Pengambilan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan tumbuhan serupa dari daerah lain.
3.3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI, Bogor.
3.3.3 Pengolahan Bahan Tumbuhan
Umbi dari bawang sabrang yang baru diambil dibersihkan dari kotoran, dicuci dengan air bersih, ditiriskan di atas kertas perkamen, dirajang, lalu
ditimbang berat basahnya. Kemudian dikeringkan di lemari pengering hingga kering dan rapuh, lalu ditimbang berat keringnya. Selanjutnya simplisia kering
diserbuk dengan blender dan disimpan dalam wadah yang kering.
3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Asam Klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes, 1979.
3.4.2 Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida hingga 100 ml Depkes, 1979.
3.4.3 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 2 g iodium dan 4 kalium iodida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.4.4 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,569 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain dilarutkan 5 g kalium iodida dalam 10 ml air suling.
Kemudian keduanya dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes,1989.
3.4.5 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,85 g bismut III nitrat dilarutkan dalam 100 ml asam asetat glasial, lalu tambahkan 40 ml air suling. Pada wadah lain dilarutkan dalam 8 g
kalium iodida dalam 20 ml air suling, kemudian campurkan kedua larutan sama banyak, lalu ditambahkan 20 ml asam asetat glasial dan diencerkan dengan air
suling hingga volume 100 ml Zweig, 1987.
3.4.6 Pereaksi Besi III Klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes RI,1989.
3.4.7 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrid dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat Harborne, 1987.
3.4.8 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh 100 ml larutan Depkes, 1979.
3.4.9 Pereaksi Kloralhidrat
Sebanyak 50 g kloralhidrat ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes, 1979.
Universitas Sumatera Utara
3.4.10 Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 N
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida secukupnya hingga 100 ml Depkes, 1989.
3.5 Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia dilakukan menurut World Health Organization 1992 penetapan kadar air dan Depkes 1989 pemeriksaan
makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu
yang tidak larut dalam asam.
3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari umbi bawang sabrang.
3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia umbi bawang sabrang. Serbuk simplisia diletakkan pada kaca objek yang telah ditetesi
larutan kloralhidrat kemudian ditutup dengan kaca penutup, dipanaskan dan diamati di bawah mikroskop. Untuk melihat pati, serbuk simplisia ditaburkan
pada kaca objek yang telah ditetesi air suling kemudian ditutup dengan kaca penutup dan diamati di bawah mikroskop.
3.5.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Cara kerja :
Ke dalam labu alas bulat dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling, didestilasi selama 2 jam. Setelah itu toluen dibiarkan mendingin selama 30 menit
Universitas Sumatera Utara
dan volume air pada tabung penerima dibaca. Kemudian ke dalam labu dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, lalu dipanaskan
hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes per detik, sampai sebagian air terdestilasi. Kemudian kecepatan destilasi
dinaikkan hingga 4 tetes per detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian
tabung penerima dibiarkan dingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua
volume air dibaca dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen.
3.5.4 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter
dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai
kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, dan sisa dipanaskan pada suhu 105º C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap
bahan yang telah dikeringkan.
3.5.5 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalam Etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan
sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa
Universitas Sumatera Utara
dipanaskan pada suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan.
3.5.6 Penetapan Kadar Abu
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijarkan pada suhu 600ºC sampai arang habis, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung
terhadap bahan yang telah dikeringkan.
3.5.7 Penetapan Kadar Abu yang Tidak Larut dalam Asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam
asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu kemudian dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 600ºC sampai
bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan.
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia dilakukan menurut Depkes 1989 alkaloid, flavonoid, glikosida, glikosida antrakinon, glikosida sianogenik,
saponin dan Farnsworth 1966 steroidtriterpenoid, tanin. 3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid
Serbuk ditimbang sebanyak 0,5 g, ditambahkan 10 ml asam klorida 0,2 N, dipanaskan di atas penangas air selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat
yang diperoleh dipakai untuk uji alkaloid. Ke dalam 4 tabung reaksi dimasukkan 0,5 ml filtrat.
Universitas Sumatera Utara
Pada masing-masing tabung reaksi : 1.
ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer 2.
ditambahkan 2 tetes larutan Iodium 3.
ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff 4.
ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari empat pereaksi
di atas.
3.6.2 Pemeriksaan Flavonoid
Serbuk ditimbang sebanyak 0,5 g, lalu ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring. Filtrat
diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambahkan 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, lalu diamkan sebentar. Lapisan metanolnya diambil,
diuapkan pada temperatur 40ºC, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etilasetat, disaring. Filtratnya digunakan untuk uji flavonoida dengan cara berikut:
a. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml
etanol 96 , lalu ditambah 0,5 g serbuk Zn dan 2 ml asam klorida 2 N, didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida
pekat. Jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid.
b. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml
etanol 96 , lalu ditambah 0,1 g serbuk Mg dan 10 tetes asam klorida pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai warna merah ungu menunjukkan
adanya flavonoid, warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon dan auron.
Universitas Sumatera Utara
3.6.3 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 96 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2 jam,
didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat
disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada temperatur
tidak lebih dari 50 C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut :
1. 0,1 ml larutan percobaan diuapkan, ditambahkan 5 ml asam asetat anhidrid dan
10 tetes asam sulfat pekat. 2.
0,1 ml larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish.
Kemudian secara perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan
menunjukkan glikosida. 3.
Serbuk sampel direbus dalam air, didinginkan, disaring. Pada filtrat ditambahkan fehling A dan fehling B 1:1, dipanaskan. Terbentuknya endapan
merah bata menunjukkan adanya gula pereduksi.
3.6.4 Pemeriksaan Glikosida Antrakinon
Serbuk ditimbang sebanyak 0,2 g, ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan
didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzen
Universitas Sumatera Utara
dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzen tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon.
3.6.5 Pemeriksaan Glikosida Sianogenik
Sebanyak 0,5 g serbuk dimasukkan ke dalam erlenmeyer, dilembabkan dengan air. Diselipkan kertas saring yang telah dibasahi natrium pikrat pada mulut
erlenmeyer, ditutup, dibiarkan terkena sinar matahari. Jika kertas saring memberikan warna merah, menunjukkan adanya sianogenik glikosida.
3.6.6 Pemeriksaan Saponin
Serbuk ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama
10 detik. Terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan
adanya saponin.
3.6.7 Pemeriksaan Steroid
Serbuk ditimbang sebanyak 1 g, dimaserasi dengan 20 ml n-heksana 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya
ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard. Terbentuknya warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru ungu atau biru hijau menunjukkan adanya
triterpenoidsteroid. 3.6.8 Pemeriksaan Tanin
Serbuk daun ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 3 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1- 2 tetes
pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.
Universitas Sumatera Utara
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 80.
Cara kerja: Sebanyak 1,3 kg serbuk simplisia dimasukkan ke dalam wadah bertutup,
dimaserasi dengan pelarut etanol 80 sampai serbuk terendam sempurna, ditutup, dibiarkan selama 120 jam terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk, disaring.
Diperoleh filtrat hasil maserasi maserat. Ampas dimaserasi kembali menggunakan prosedur yang sama selama 48 jam. Pengerjaan dilakukan
berulangkali hingga maserat hampir tidak memberikan warna. Maserat yang diperoleh digabungkan, kemudian diuapkan dengan bantuan penguap vakum putar
pada suhu ± 40 C sampai diperoleh ekstrak kental. Bagan ekstraksi serbuk
simplisia umbi bawang sabrang dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 51.
3.7 Isolasi Senyawa Alkaloid dari Ekstrak Etanol dengan Metode Pengocokan Asam Basa
Kategori