Pemilihan dosis mengikuti progresi geometris Harmita Radji 2008. Rumus yang digunakan sebagai berikut:
Y
N
= Y
1
R
N-1
Keterangan: Y
N
= dosis ke-N Y
1
= dosis pertama R = faktor pemacu
N = deret dosis
Mencit yang digunakan adalah mencit betina, strain DDY dengan bobot badan berkisar 21.7–40.8 g yang berumur 2.5−3 bulan. Jumlah mencit untuk
setiap jenis ekstrak S. ornata, S. plana, dan S. willdenovii masing-masing sebanyak 4 ekor. Selanjutnya efek toksik ekstrak dievaluasi selama 7 hari
Harmita Radji 2008 dan dihitung dosis letal median LD
50
. Rumus yang digunakan pada metode Weil 1952 sebagai berikut:
Log m = log D + df+1
Keterangan: m = nilai LD
50
D = Dosis terkecil yang diberikan d = log dari kelipatan dosis log R
f = suatu faktor dalam tabel Weil
2.2 Pemberian Ekstrak Selaginella dan Cekaman Oksidatif
Metode pemberian ekstrak dan cekaman oksidatif merupakan modifikasi dari metode yang digunakan oleh Gayathri et al. 2005 dan Wresdiyati et al.
2007. Cekaman oksidatif diberikan dengan cara puasa tidak diberi pakan dan berenang selama lima menit setiap hari dengan pemberian air minum secara ad
libitum selama 3 hari. Untuk menganalisis pengaruh ekstrak Selaginella terhadap
aktivitas antioksidan secara in vivo digunakan mencit jantan dengan bobot badan
berkisar 21.3–43 g yang berumur 2.5−3 bulan. Kontrol terdiri dari: 1 kontrol negatif yaitu mencit yang tidak mendapat ekstrak, namun mendapat cekaman
oksidatif, 2 kontrol positif yaitu mencit yang mendapat ekstrak dosis 0.6 g ekstrakkg bb, tetapi tanpa cekaman oksidatif, dan 3 kontrol netral yaitu mencit
yang tetap mendapatkan pakan dan tidak mendapat cekaman maupun ekstrak. Pada setiap ekor mencit percobaan diberi 0.5 ml ekstrak dengan dosis sesuai
perlakuan. Pada hari kelima mencit-mencit tersebut dimatikan dan contoh hati diambil.
2.3 Persiapan Homogenat Hati
Hati yang telah diperoleh dari hasil pembedahan direndam dengan NaCl 0.9 dan selanjutnya disimpan dalam larutan KCl 1.15 Ohkawa et al. 1979.
Dari larutan KCl 1.15, dicuci dengan aquabides dan dibuat homogenat 25 menggunakan aquabides Gayathri et al. 2005 dan Lampiran 9. Pembuatan
homogenat dengan cara dihaluskan, disaring, dan disimpan pada suhu –20ºC untuk pengujian selanjutnya Hasani et al. 2007. Dari bahan homogenat tersebut,
diambil masing-masing 0.1–1 ml untuk analisis peroksidasi lipid dan analisis Superoksida Dismutase.
2.4 Analisis Peroksidasi Lipid
Analisis peroksidasi lipid untuk penentuan konsentrasi MDA malondialdehyde dalam nmolµg protein dimulai dengan analisis protein.
Analisis protein pada homogenat hati mencit menggunakan metode biuret.
Metode biuret merupakan salah satu cara yang terbaik untuk menentukan kadar protein suatu larutan Apriyantono et al. 1989.
Pereaksi biuret terdiri dari larutan 3 g CuSO
4
.5H
2
O dan 9 g Na-K-Tartrat dalam 500 ml NaOH 0.2 N. Selanjutnya larutan ditambah 5 g KI kemudian
diencerkan sampai 1000 ml dengan menggunakan NaOH 0.2 N. Larutan protein standar merupakan larutan bovine serum albumin BSA
dalam aquades dengan konsentrasi 5 mgml.
Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan BSA dengan konsentrasi 5 mgml pada 7 macam volume yang berbeda yaitu 0 blanko, 0.1,
0.2, 0.4, 0.6, 0.8 dan 1 ml larutan protein standar dengan menambahkan aquades sampai volume total masing-masing 4 ml. Selanjutnya larutan ditambah dengan 6
ml pereaksi Biuret dan dicampur dengan menggunakan vortex. Larutan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37
º
C selama 10 menit sampai pembentukan warna biru sempurna dan pengukuran absorbansinya dilakukan pada panjang gelombang
520 nm. Untuk penetapan sampel sebanyak 0.5 ml dilakukan dengan membagi
homogenat ke dalam tabung reaksi seperti pada waktu penetapan standar, kemudian ditambah air sampai volume total masing-masing 1 ml. Selanjutnya
larutan ditambah 1 ml Trichloroacetic acid TCA 10 sehingga protein akan terdenaturasi. Selanjutnya larutan disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 10
menit sampai protein yang terdenaturasi mengendap, dan supernatan dibuang dengan cara dekantasi. Endapan ditambah 2 ml etil eter dan dicampur merata lalu
disentrifus kembali untuk menolong menghilangkan residu TCA dan dibiarkan mengering pada suhu kamar. Selanjutnya endapan kering ditambah 4 ml aquades
dan dicampur merata, sampai larut seluruhnya. Larutan ditambah dengan 6 ml pereaksi Biuret, dan larutan alkali dalam pereaksi ini akan melarutkan endapan
yang tersisa. Larutan tersebut dicampur dan diinkubasi pada suhu 37
º
C selama 10 menit sampai terbentuk warna biru sempurna dan pengukuran absorbansinya
dilakukan pada panjang gelombang 520 nm.
Analisis peroksidasi lipid diuji dengan sistem Fe
2+
- askorbat Gayathri et al.
2005. Campuran reaksi terdiri dari 0.1 ml homogenat hati 25, 0.1 ml larutan penyangga Tris-HCl 1M pH 7, 0.1 ml asam askorbat 1.5 mM, 0.1 ml Fe-
ammonium sulfat 4 mM, dan 0.1 ml aquabides hingga seluruhnya mencapai volume 0.5 ml. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37
º
C selama 1 jam. Kandungan peroksidasi lipid diukur sebagai senyawa asam tiobarbiturat yang
terukur dengan metode dari Ohkawa et al. 1979 dan Mihara et al. 1980. Setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37ºC, campuran tersebut
ditambah dengan 0.5 ml larutan Trichloroacetic Acid TCA 0.1 wv yang mengandung Butylated Hydroxytoluene BHT 1mM pada suhu 4
º
C. Homogenat tersebut kemudian ditambah 3 ml larutan H
3
PO
4
2 vv dan 1 ml TBA 0.6 wv dalam TCA 20 wv. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 100
º
C
selama 30 menit, kemudian didinginkan sampai mencapai suhu ruang. Setelah dingin campuran ditambah 4 ml n-butanol 100 vv kemudian di kocok dengan
kuat menggunakan vortex. Fase butanol dan fase larutan dipisahkan dengan sentrifugasi 3000 rpm selama 30 menit Labofuge 400R. Absorbansi kompleks
TBA-MDA pada fase butanol diukur dengan spektrofotometer pada 532 nm, sedangkan untuk nilai absorban non spesifik diukur pada 520 nm. Konsentrasi
MDA sebagai produk akhir peroksidasi lipid dapat dihitung dengan mengurangi nilai absorban pada 532 nm dengan nilai absorban pada 520 nm.
Tingkat peroksidasi lipid dicerminkan oleh konsentrasi MDA yang terbentuk yang dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
MDA Ɛ x d
Keterangan: [MDA] = Konsentrasi MDA yang terbentuk nmol A
= Selisih nilai absorban Ɛ
= Nilai ekstansi MDA 155 mM
-1
cm
-1
d = Lebar kuvet cm
v = Volume sampel ml
Persen penghambatan dari pembentukan peroksida lipid ditentukan dengan cara membandingkan hasil dari contoh yang diberi dan tidak diberi perlakuan
ekstrak Selaginella.
2.5 Analisis Superoksida Dismutase SOD
