selama 30 menit, kemudian didinginkan sampai mencapai suhu ruang. Setelah dingin campuran ditambah 4 ml n-butanol 100 vv kemudian di kocok dengan
kuat menggunakan vortex. Fase butanol dan fase larutan dipisahkan dengan sentrifugasi 3000 rpm selama 30 menit Labofuge 400R. Absorbansi kompleks
TBA-MDA pada fase butanol diukur dengan spektrofotometer pada 532 nm, sedangkan untuk nilai absorban non spesifik diukur pada 520 nm. Konsentrasi
MDA sebagai produk akhir peroksidasi lipid dapat dihitung dengan mengurangi nilai absorban pada 532 nm dengan nilai absorban pada 520 nm.
Tingkat peroksidasi lipid dicerminkan oleh konsentrasi MDA yang terbentuk yang dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
MDA Ɛ x d
Keterangan: [MDA] = Konsentrasi MDA yang terbentuk nmol A
= Selisih nilai absorban Ɛ
= Nilai ekstansi MDA 155 mM
-1
cm
-1
d = Lebar kuvet cm
v = Volume sampel ml
Persen penghambatan dari pembentukan peroksida lipid ditentukan dengan cara membandingkan hasil dari contoh yang diberi dan tidak diberi perlakuan
ekstrak Selaginella.
2.5 Analisis Superoksida Dismutase SOD
Analisis SOD menggunakan metode Kubo et al. 2002, Wijeratne et al. 2005, dan Prangdimurti et al. 2006 dengan sedikit modifikasi. Penggunaan
metode ini untuk mengukur aktivitas menangkap radikal anion superoksida yang dihasilkan secara enzimatis oleh sistem xantin-xantin oksidase.
Sebanyak 0.06 ml homogenat hati direaksikan dengan larutan yang terdiri dari 2.7 ml bufer Natrium Karbonat 40 mM yang mengandung EDTA 0.1 mM
pH 10, 0.06 ml Xantin 10 mM, 0.03 ml BSA 0.5, dan 0.03 ml NBT nitroblue tetrazolium 2.5 mM. Selanjutnya larutan ditambah dengan 100 µl 0.1 ml Xantin
Oksidase 0.04 units. Absorbansi yang dihasilkan setelah 30 menit diukur pada panjang gelombang 560 nm. Sebagai kontrol digunakan larutan yang digunakan
dalam persiapan sampel hati yaitu 11.5 gl KCl PBS yang mengandung 11.5 gl KCl. Aktivitas SOD dihitung dengan menggunakan persamaan berikut:
B
Keterangan: A= absorbansi larutan sampel B= absorbansi larutan kontrol
Analisis Data
Analisis data dilakukan dengan uji sidik ragam ANOVA. Jika dari hasil analisis ragam perlakuan berpengaruh nyata terhadap peubah yang diamati maka
dilanjutkan dengan uji Duncan Multi Range Test DMRT dengan tingkat kepercayaan 95.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil 1. Kondisi mencit dan Nilai LD
50
Dosis Letal Median
Mencit yang digunakan dalam uji LD
50
adalah strain DDY berwarna putih Lampiran 1 yang memenuhi syarat untuk digunakan dalam penentuan LD
50
. Adapun alasan digunakan mencit dalam percobaan karena selain hewan-hewan
tersebut ekonomis, mudah didapat, dan mudah dirawat, data-data toksikologinya sudah tersedia sehingga memudahkan pembandingan toksisitas zat kimia satu
dengan yang lain Harmita Radji 2008. Studi pendahuluan penentuan LD
50
menggunakan dosis 15 g ekstrakkg bb bertujuan untuk mengetahui tingkat toksisitas bahan alami pada Selaginella. Hasil
studi pendahuluan LD
50
menunjukkan bobot badan mencit yang masih hidup pada ketiga macam ekstrak Selaginella berbeda-beda. Pada akhir pengamatan, mencit
yang memperoleh ekstrak S. ornata dan S. plana mengalami peningkatan bobot badan berturut-turut 1.1 dan 0.5 g, sedangkan mencit yang memperoleh ekstrak
S. willdenovii mengalami penurunan bobot badan 1.2 g Gambar 6 dan 7.
‐1.5 ‐1
‐0.5 0.5
1 1.5
SO SP
SW
Perubahan bobot badan g
Jenis ekstrak
Gambar 6 Perubahan bobot badan mencit di akhir uji pendahuluan LD
50
pada S. ornata
SO, S. plana SP, dan S. willdenovii SW.
Tingkat mortalitas kematian untuk masing-masing ekstrak Selaginella sama yaitu 80 4 ekor Lampiran 2. Mencit mengalami kematian setelah 24
jam pemberian ekstrak Selaginella. Pada mencit yang masih hidup dan mendapat ekstrak S. ornata dan S. plana mengalami peningkatan bobot badan mulai dari
hari ke-1 sampai dengan hari ke-4, setelah itu bobot badan berfluktuasi sampai hari ke-7. Mencit yang mendapat ekstrak S. willdenovii mengalami penurunan
bobot badan pada hari ke-4 2.6 g, kemudian mengalami peningkatan kembali pada hari ke-5 3.1 g, dan selanjutnya mengalami penurunan kembali pada hari
ke-7 1.6 g Gambar 7 dan Lampiran 2.
Gambar 7 Perubahan bobot badan mencit selama uji pendahuluan LD
50
dengan 15 g ekstrak kg bb. Mencit mendapat ekstrak S. ornata ,
S. plana dan S. willdenovii .
26 27
28 29
30 31
32 33
34
1 2
3 4
5 6
7
Bobot badan g
Hari setelah pemberian ekstrak
Pengujian LD
50
selanjutnya dari ketiga jenis ekstrak Selaginella dilakukan dengan empat dosis yang berbeda. Hasil pengujian menunjukkan adanya
perubahan bobot badan yang berbeda-beda pada mencit yang masih hidup. Pada umumnya tingkat mortalitas meningkat dengan meningkatnya dosis pemberian
ekstrak Selaginella. Tingkat mortalitas mencit yang mendapat ekstrak S. ornata dan S. plana mengalami peningkatan setelah mendapat dosis 9 g ekstrakkg bb,
sedangkan tingkat mortalitas pada mencit yang mendapat ekstrak S. willdenovii mengalami peningkatan mulai dari pemberian dosis 3 g ekstrakkg bb Tabel 1
dan Lampiran 3. Tabel 1 Pengujian LD
50
ekstrak S. ornata, S. plana, dan S. willdenovii Jenis ekstrak
Dosis g ekstrakkg bb
Jumlah mencit mati ekor
Mortalitas S. ornata
1 2
50 3
9 2
50 27
4 100
S. plana 1
3 9
4 100
27 4
100 S. willdenovii
1 3
3 75
9 3
75 27
4 100
Berdasarkan jumlah kematian mencit diperoleh nilai LD
50
yang berbeda dari ketiga jenis ekstrak. Nilai LD
50
ekstrak S. ornata, S. plana, dan S. willdenovii berturut-turut 9, 5.2, dan 3 g ekstrakkg bb Lampiran 4. Selanjutnya untuk
pengujian in vivo digunakan tiga macam dosis yaitu 0.3, 0.6, dan 1.2 g ekstrakkg bb. Penentuan dosis ini berdasarkan kurva hubungan antara sifat kurva dosis
dengan efek kuantal yang menunjukkan adanya suatu jarak antara ED
50
dengan LD
50
sebesar sepersepuluh sampai seperduapuluh dari hasil distribusi frekuensi kumulatif Harmita Radji 2008.
2. Efektifitas Pemberian Cekaman Oksidatif
