Analisis Peroksidasi Lipid Aktivitas Antioksidan 1 Uji LD50
0.2, 0.4, 0.6, 0.8 dan 1 ml larutan protein standar dengan menambahkan aquades sampai volume total masing-masing 4 ml. Selanjutnya larutan ditambah dengan 6
ml pereaksi Biuret dan dicampur dengan menggunakan vortex. Larutan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37
º
C selama 10 menit sampai pembentukan warna biru sempurna dan pengukuran absorbansinya dilakukan pada panjang gelombang
520 nm. Untuk penetapan sampel sebanyak 0.5 ml dilakukan dengan membagi
homogenat ke dalam tabung reaksi seperti pada waktu penetapan standar, kemudian ditambah air sampai volume total masing-masing 1 ml. Selanjutnya
larutan ditambah 1 ml Trichloroacetic acid TCA 10 sehingga protein akan terdenaturasi. Selanjutnya larutan disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 10
menit sampai protein yang terdenaturasi mengendap, dan supernatan dibuang dengan cara dekantasi. Endapan ditambah 2 ml etil eter dan dicampur merata lalu
disentrifus kembali untuk menolong menghilangkan residu TCA dan dibiarkan mengering pada suhu kamar. Selanjutnya endapan kering ditambah 4 ml aquades
dan dicampur merata, sampai larut seluruhnya. Larutan ditambah dengan 6 ml pereaksi Biuret, dan larutan alkali dalam pereaksi ini akan melarutkan endapan
yang tersisa. Larutan tersebut dicampur dan diinkubasi pada suhu 37
º
C selama 10 menit sampai terbentuk warna biru sempurna dan pengukuran absorbansinya
dilakukan pada panjang gelombang 520 nm.
Analisis peroksidasi lipid diuji dengan sistem Fe
2+
- askorbat Gayathri et al.
2005. Campuran reaksi terdiri dari 0.1 ml homogenat hati 25, 0.1 ml larutan penyangga Tris-HCl 1M pH 7, 0.1 ml asam askorbat 1.5 mM, 0.1 ml Fe-
ammonium sulfat 4 mM, dan 0.1 ml aquabides hingga seluruhnya mencapai volume 0.5 ml. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37
º
C selama 1 jam. Kandungan peroksidasi lipid diukur sebagai senyawa asam tiobarbiturat yang
terukur dengan metode dari Ohkawa et al. 1979 dan Mihara et al. 1980. Setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37ºC, campuran tersebut
ditambah dengan 0.5 ml larutan Trichloroacetic Acid TCA 0.1 wv yang mengandung Butylated Hydroxytoluene BHT 1mM pada suhu 4
º
C. Homogenat tersebut kemudian ditambah 3 ml larutan H
3
PO
4
2 vv dan 1 ml TBA 0.6 wv dalam TCA 20 wv. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 100
º
C
selama 30 menit, kemudian didinginkan sampai mencapai suhu ruang. Setelah dingin campuran ditambah 4 ml n-butanol 100 vv kemudian di kocok dengan
kuat menggunakan vortex. Fase butanol dan fase larutan dipisahkan dengan sentrifugasi 3000 rpm selama 30 menit Labofuge 400R. Absorbansi kompleks
TBA-MDA pada fase butanol diukur dengan spektrofotometer pada 532 nm, sedangkan untuk nilai absorban non spesifik diukur pada 520 nm. Konsentrasi
MDA sebagai produk akhir peroksidasi lipid dapat dihitung dengan mengurangi nilai absorban pada 532 nm dengan nilai absorban pada 520 nm.
Tingkat peroksidasi lipid dicerminkan oleh konsentrasi MDA yang terbentuk yang dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
MDA Ɛ x d
Keterangan: [MDA] = Konsentrasi MDA yang terbentuk nmol A
= Selisih nilai absorban Ɛ
= Nilai ekstansi MDA 155 mM
-1
cm
-1
d = Lebar kuvet cm
v = Volume sampel ml
Persen penghambatan dari pembentukan peroksida lipid ditentukan dengan cara membandingkan hasil dari contoh yang diberi dan tidak diberi perlakuan
ekstrak Selaginella.