suhu 37
o
C. Microplate dicuci dengan wash buffer menggunakan volume 300 l tiap sumuran sebanyak 4x dan dikeringkan dengan cara membalik
balik secara kuat microplate hingga tidak ada lagi droplet pada sumuran.
Sejumlah 100 l detector antibody ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi larutan standard an sampel, microplate ditutup kembali.
Microplate ditempatkan pada ELISA reader dan diinkubasi pada suhu
37
o
C selama 30 menit. Pencucian kedua dilakukan dengan wash buffer dengan volume 300 l tiap sumuran sebanyak 4x dan dikeringkan.
Sebanyak 100 l substrat larutan berisi TMB ditambahkan ke dalam semua sumuran termasuk ke dalam sumuran larutan standar bovine IgG
dan blanko. Microplate
diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit, akan terbentuk warna biru. Semua sumuran ditambahkan 100 l stop solution,
akan terjadi perubahan warna menjadi kuning. Microplate ditempatkan dan dilakukan pembacaan pada ELISA reader pada panjang gelombang
450 nm dalam rentang waktu 15 menit. Berdasarkan densitas optik yang diperoleh, dibuat kurva baku dari rata rata densitas optik masing–masing
pengukuran pada semua sumuran. Analisis hasil dilakukan dengan program SkanIt Software dari Multiskan GO, Thermo scientific, kemudian
dianalisis secara statistik melalui spreadsheet Excel.
3.3.2 PENETAPAN KADAR OPTIMUM IgG DALAM SAMPEL SUSU BUBUK SKIM
Pada penetapan kadar optimum IgG dalam sampel susu bubuk skim yang akan digunakan pada validasi metode analisis, dilakukan pembuatan
kurva baku yang validitasnya sudah diketahui dari seri larutan baku IgG dengan rentang kadar 0-125 ngml. Seri larutan baku dibuat dengan
mengencerkan larutan standar bovine IgG 125ngml dengan assay diluent
pada kadar: 125 ngml; 62.5 ngml; 31.25 ngml; 15.6 ngml; 7.8 ngml; dan 0 ngml. Kalibrasi kurva baku dengan membuat suatu seri
larutan standar. Larutan stok sampel susu bubuk skim disiapkan dengan
menimbang 15 mg susu bubuk skim sampel dengan kadar IgG 150mg 15g ke dalam labu volumetrik 10 ml, ditambahkan air suling hingga
batas dan dikocok kuat hingga homogen. Larutan stok sampel 1,5mgmL diencerkan secara bertingkat dalam assay diluent dengan perbandingan
110 hingga diperoleh pengenceran : A 110; B 1100; C 1500 dan E 11000. Larutan pengenceran diperoleh dengan cara memipet larutan
stok sampel sejumlah 100 l dan ditambahkan 900 l assay diluents dan pengenceran selanjutnya dilakukan sama hingga diperoleh tingkat
pengenceran akhir 11000. Microplate
disiapkan dan kemudian dipipet 200 l masing-masing larutan baku dan sampel ke dalam sumuran dilakukan duplo, dilakukan
prosedur ELISA sama seperti yang tertera pada 3.3.1 pada pembuatan kurva dan kalibrasi kurva baku. Berdasarkan densitas optiik yang
diperoleh, dengan menggunakan kurva baku selanjutnya dihitung kadar IgG dalam masing-masing tiap kadar sampel yang ditetapkan.
3.3.3 LINIERITAS DAN RENTANG
Untuk uji linieritas dan rentang, dibuat kurva baku dari satu seri larutan standar bovine IgG 125ngml. Seri larutan baku dibuat dengan
mengencerkan larutan standar bovine IgG 125ngml dengan assay diluent
pada kadar: 125 ngml; 62.5 ngml; 31.25 ngml; 15.6 ngm l; 7.8 ngml; dan 0 ngml. Kalibrasi kurva baku dengan melakukan replikasi
sejumlah 7 kali untuk tiap konsentrasi baku dan dihitung nilai r. Linieritas memenuhi syarat jika r hitung 0,95.
Microplate disiapkan dan kemudian dipipet 200 l larutan baku ke
dalam sumuran dilakukan duplo, dilakukan prosedur ELISA sama seperti yang tertera pada 3.3.1 pada pembuatan kurva dan kalibrasi kurva baku.
Berdasarkan densitas optik yang diperoleh, dengan menggunakan kurva baku selanjutnya dihitung kadar IgG dalam masing-masing tiap kadar
sampel yang ditetapkan.
3.3.4 PENETAPAN LIMIT DETEKSI DAN LIMIT KUANTITASI
