Beberapa pengujian hanya menggunakan dua atau tiga pengenceran serum atau imunoglobulin yang dimurnikan untuk
menggambarkan bagian linier kurva hubungan antara absorbansi dan konsentrasi imunoglobulin dalam suatu sampel. Namun kurva baku yang
dibuat berdasarkan satu seri pengenceran memungkinkan penghitungan konsentrasi imunoglobulin dalam sampel yang berada diluar kisaran
liniernya. Perhitungan dapat dilakukan dengan cara manual maupun dengan
program komputer grafik yang menghubungkan absorbansi dengan konsentrasi imunoglobulin
. Format ELISA yang sangat umum digunakan
adalah Sandwich ELISA terutama untuk identifikasi protein.
2.4 VALIDASI METODE ANALISIS
Metode analisis yang reliabel dan valid digunakan untuk kesesuaian dengan regulasi nasional dan internasional. Laboratorium harus dapat
memperlihatkan bahwa data yang diperoleh dari hasil pengujian bermutu. Maka validasi metode merupakan hal yang sangat esensial untuk
menghasilkan metode yang dapat dipercaya dan data yang diperoleh reliabel.
Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang obyektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus
dipenuhi SNI 17025: 2008. Menurut Gunzler 1996, validasi metode adalah menetapkan
dengan percobaan laboratorium yang sistimatik, pemenuhan karakteristik unjuk kerja metode terhadap spesifikasi yang dikaitkan dengan penggunaan
hasil pengujian yang dimaksudkan. Validasi metode adalah suatu proses untuk mengonfirmasi bahwa suatu metode mempunyai unjuk kerja yang
konsisten, sesuai dengan apa yang dikehendaki dalam penerapan metode tersebut Eurachem 1998.
Jadi tujuan memvalidasi metode adalah untuk mengetahui sejauh mana penyimpangan suatu metode tidak dapat dihindari pada kondisi
normal, dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar. Dengan memvalidasi metode, tingkat kepercayaan yang dihasilkan
oleh suatu metode pengujian dapat diperkirakan dengan pasti Hadi 2007 Dengan kata lain validasi merupakan proses mendapatkan informasi
penting untuk menilai kemampuan sekaligus keterbatasan suatu metode untuk memperoleh hasil yang dapat dipercaya, menentukan kondisi dimana
hasil data uji diperoleh dan menentukan batas suatu metode seperti akurasi, presisi, batas deteksi dan kuantitasi, pengaruh matriks dan parameter
lainnya. Validasi metode sangat penting karena menyangkut elemen-elemen yang dapat mempengaruhi seperti personil, peralatan instrumentasi, analat,
kondisi lingkungan, sampel dan waktu yang semuanya merupakan faktor yang dapat menimbulkan variasi pada suatu pengujian.
Menurut Boque 2002, suatu metode analisis dikatakan memuaskan bila memenuhi kriteria kinerja diantaranya:
1. Peka artinya metode harus dapat digunakan untuk menetapkan kadar
senyawa dalam kadar yang kecil. 2.
Tepat presisi artinya metode tersebut menghasilkan suatu hasil analisis yang sama atau hampir sama dalam satu seri pengukuran
penetapan. 3.
Teliti akurat artinya metode dapat menghasilkan nilai rata-rata yang sangat dekat dengan nilai sebenarnya true value,
4. Spesifik, artinya untuk penetapan kadar senyawa tertentu, dan metode
tersebut tidak banyak terpengaruh oleh adanya senyawa lain. 5.
Praktis artinya metode tersebut mudah dikerjakan serta tidak banyak memerlukan waktu dan biaya.
Dengan melakukan validasi metode akan diketahui sejauh mana penyimpangan yang tidak dapat dihindari dari suatu metode pada kondisi
normal dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar. Dengan demikian dapat diperhitungkan dengan pasti tingkat
kepercayaan yang dihasilkan oleh suatu metode pengujian. Dalam melaksanakan validasi metode ada beberapa faktor-faktor yang harus
diperhatikan adalah keseimbangan antara biaya, waktu, risiko dan aspek teknis misalnya ketepatan dan ketelitian yang diinginkan untuk analisis
kuantitatif, ketersediaan reagen serta peralatan yang tersedia
.
Pada waktu dilakukan validasi metode ada beberapa hal yang harus diperhatikan antara lain perbedaan suhu, personil, instrumen, pereaksi yang
dipakai dalam metode baku atau metode resmi dengan laboratorium yang akan menggunakannya. Sehingga tujuan validasi adalah untuk memastikan,
bahwa laboratorium atau personelanalis dapat menerapkan metode tersebut dengan baik dengan adanya ketersediaan peralatan, fasilitas pereaksi,
penguji,yang trampil, dan kompeten. Validasi metode harus dilakukan bila metode tidak baku, metode
yang didesaindikembangkan laboratorium, metode baku yang digunakan diluar lingkup yang dimaksudkan atau metode baku yang dimodifikasi.
Validasi ada dua jenis yaitu validasi primer primary validation dan validasi sekunder secondary validation. Validasi primer adalah validasi
yang dilakukan untuk metode analisis baru, hasil pengembangan atau metode yang dimodifikasi terhadap suatu metode standar. Validasi sekunder
adalah validasi yang dilakukan untuk verifikasi metode analisis yang diadopsi atau metode standar yang telah divalidasi. Parameter uji yang
dilakukan untuk validasi metode kuantitatif dan metode kualitatif tercantum pada Tabel 2.
Tabel 2. Parameter yang diperlukan pada validasi metode analisis untuk uji kualitatif dan kuantitatif
Parameter Uji Kualitatif
Uji kuantitatif Akurasi
Tidak perlu Perlu
Presisi Tidak perlu
Perlu Spesifisitas
Perlu Perlu
Limit deteksi Perlu
Perlu Limit kuantitasi
Tidak perlu Perlu
Linearitas Tidak perlu
Perlu Rentang
Perlu Perlu
Keberulangan Perlu
Perlu Robustness
Perlu Perlu
Ruggedness perlu
Perlu Beberapa parameter unjuk kerja yang harus diperhatikan ketika
melakukan validasi metode yaitu 1 akurasi, 2 presisi, 3 sensitivitas, 4 spesifisitas, 5 limit deteksi LOD, 6 limit kuantitasi LOQ, 7
Ruggedness , 8 Robustness, dan 9 linearitas. Menurut USP 2011
tercantum validasi sekunder untuk metode kompendia dan validasi primer untuk metode alternatif.
Presisi adalah tingkat kesamaan degree of agreement antar hasil uji individual ketika metode tersebut diterapkan secara berulang sampai dengan
penggandaan sampling dari suatu sampel homogenat. Presisi dari suatu metode analisis biasanya ditunjukkan dengan simpangan baku relatif
relative standard deviation atau coefficient of variation dari suatu seri pengukuran. Untuk menganalisis hasil validasi, data presisi dapat dievaluasi
menggunakan persen standar deviasi relatif RSD. Menurut USP 2011 presisi adalah derajat kesesuaian diantara hasil
uji individu berdiri sendiri jika metode uji dilakukan berulang-ulang terhadap multi sampling dari suatu sampel yang homogen. Presisi biasanya
dinyatakan sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif koefisien variasi dari serangkaian pengukuran. Suatu metode analisis dapat diadopsi
dalam suatu laboratorium jika nilai RSD 5. Menurut Chan 2002 presisi suatu metode khususnya metode ELISA akan memenuhi
keberterimaan apabila RSD yang diperoleh 20. Presisi dapat diukur dari tingkat ripitabilitas atau tingkat reprodusibilitas dari metode analisis yang
dilakukan dalam kondisi normal. Ripitabilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen
yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam laboratorium yang sama oleh operator analis yang sama dengan
menggunakan peralatan yang sama dalam interval waktu singkat. Ripitabilitas dapat juga dikatakan penggunaan metode pengujian di dalam
satu laboratorium dalam satu periode waktu yang singkat menggunakan personel penguji yang sama, dengan peralatan yang sama di bawah kondisi
konstan. Reprodusibilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen
yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam laboratorium yang berbeda dan peralatan berbeda, atau dengan analis
dan peralatan berbeda di dalam laboratorium yang sama. Presisi intermediat dilakukan dengan berbagai variasi di dalam laboratorium, seperti pada hari
yang berbeda atau personil penguji yang berbeda atau alat yang berbeda dalam laboratorium yang sama. Reprodusibilitas adalah penggunaan metode
pengujian dalam berbagai laboratorium yang berbeda seperti dalam uji kolaborasi.
Akurasi adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur suatu nilai yang aktual atau sebenarnya dari suatu analat. Apabila suatu analat
secara alami digunakan sebagai uji tantang atau uji profisiensi, metode tersebut harus mampu mendeteksi atau memunculkan kembali rekoveri
analat pada konsentrasi yang benar atau frekuensinya mendekati akurat. Akurasi adalah ukuran ketepatan dari suatu metode pengujian, atau
kedekatan antara nilai hasil uji yang diukur dengan nilai benar, atau nilai nilai konvensional atau nilai acuan yang dapat diterima USP 2011.
Menurut Boque 2002 akurasi atau kecermatan adalah kedekatan hasil uji yang diperoleh dengan menggunakan metode yang sedang
divalidasi dengan nilai sebenarnya yang terdapat dalam sampel uji. Akurasi
biasanya dinyatakan
sebagai persen
rekoveri. Pada
analisis direkomendasikan minimal 9 replikasi atau 3 replikasi dengan 3 konsentrasi
dengan kriteria kecermatan sangat tergantung kepada konsentrasi analat dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode RSD.
Suatu metode analisis dapat diadopsi jika hasil validasi memperoleh nilai rekoveri sesuai dengan keberterimaan. Akurasi dari suatu metode dapat
dilakukan dengan cara menggunakan bahan acuan bersertifikat, membandingkan hasil yang benar-benar telah dikarakterisasi dan akurasinya
telah ditetapkan atau dengan cara menghitung persen perolehan kembalirekoveri terhadap sampel yang sudah di spike Chan 2004. Kriteria
kecermatan dalam persen perolehan kembali sangat tergantung kepada konsentrasi analat dalam matrikss sampel dan pada keseksamaan metode
RSD Codex 2009. Persen rekoveri rata-rata untuk tiap level konsentrasi dinilai terhadap rentang persen rekoveri tercantum pada Tabel 3.
Penetapan batas terendah dari kisaran hitung limit deteksi adalah konsentrasi terendah dari analat dalam sampel yang dapat terdeteksi, akan
tetapi tidak perlu terkuantisasi, dibawah kondisi pengujian yang disepakati. Sedang Limit kuantitasi biasa juga disebut sebagai batas pelaporan adalah
konsentrasi terendah dari analat yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima, dibawah kondisi pengujian yang
disepakati. Limit deteksi merupakan jumlah terkecil analat dalam sampel yang
dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. Limit deteksi merupakan parameter uji batas, dan limit
kuantitasi diartikan sebagai kuantitas terkecil analat dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.
Penentuan limit deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang
tidak menggunakan instrumen limit tersebut ditentukan dengan mendeteksi analat dalam sampel pada pengenceran bertingkat.
Tabel 3. Keberterimaan akurasi berdasarkan persen rekoveri
No Analat
Rasio Analat
Satuan Rentang
keberterimaan Rekoveri
1 100
1 100
100g100g 98 – 102
2 10
10
-1
10 10g100g
98 – 102 3
1 10
-2
1 1g100g
97 – 103 4
0,1 10
-3
0,1 1 mgg
95 – 105 5
0,01 10
-4
100 ppm 90 – 107
6 0,001
10
-5
10 ppm 80 – 110
7 0,0001
10
-6
1 ppm 80 – 110
8 0,00001
10
-7
100 ppb 80 – 110
9 0,000001
10
-8
10 ppb 60 – 115
10 0,0000001
10
-9
1 ppb 40 – 120
Pada analisis menggunakan instrumen, limit deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blanko beberapa kali lalu dihitung simpangan
baku respon blanko. limit deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. Limit deteksi
mempunyai nilai ekuivalen dengan rata-rata respon blanko plus 3 kali simpangan baku SD, dan limit kuantitasi adalah rata-rata blanko plus 10
kali SD Eurachem 2002. Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan
bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analat yang proposional dengan konsentrasi, secara langsung atau
melalui transformasi matematika. Linieritas adalah kemampuan untuk menghasilkan hasil uji yang sebanding berbanding lurus terhadap
konsentrasi analat dalam sampel pada kisaran konsentrasi tertentu. Beberapa metode seperti immunoassay tidak menghasilkan suatu kurva yang linier,
pada kasus ini respon analisis dapat digambarkan sebagai fungsi yang sesuai
dengan konsentrasi Rentang yaitu kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang kadar analatnya masih linier dengan presisi dan akurasi yang masih
dapat diterima analat dalam sampel USFDA 1996. Ditetapkan bersamaan dengan penetapan linieritas dengan melakukan pengujian terhadap sampel
yang kadarnya dibawah dan diatas normal. Rentang metode menjelaskan rentang konsentrasi dimana metode uji diaplikasikan yang dinyatakan dalam
presisi, akurasi dan linieritas. Selektivitas
seringkali dapat
dinyatakan sebagai
derajat penyimpangan degree of bias metode yang dilakukan terhadap sampel
yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil
analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Selektivitas menunjukkan kemampuan suatu metode membedakan antara
analat yang dituju dan komponen lain bentuk-bentuk analat lain yang mungkin ada dalam matriks untuk mengukur secara akurat dan spesifik
analat dalam matrikss sampel dengan adanya zat pengganggu. Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksimengukur
analat secara
cermat dan
seksama dengan
adanya analat
asingbahanmatriks lain. Spesifisitas dapat dihitung menggunakan jumlah sampel positif yang menunjukkan hasil pengujian positif dibagi dengan
hasil pengujian positif terhadap kontrol positif dikalikan 100. Hasil penghitungan menunjukkan nilai perolehan kembali rekoveri dari hasil
validasiverifikasi metode analisis. Pada analisis mikrobiologi, idealnya nilai rekoveri 80 tetapi metode analisis dianggap meyakinkan jika nilai
rekoveri berkisar 50 - 95 AOAC 1999. Menurut DeSilva 2003 idealnya pada metode ELISA, antibodi
yang digunakan harus spesifik dengan analat target, tanpa adanya gangguan dari bahan yang strukturnya hampir sama dengan analat yang
ada dalam sampel ataupun bahan yang terdapat dalam matriks. Sensitivitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksimengukur analat target
dalam jumlah sekecil mungkin.
Ruggedness atau kekasaran adalah suatu ukuran dari kapasitasnya,
terhadap sisa yang tidak dipengaruhi oleh konsentrasi yang sedikit, namun variasi-variasi yang mungkin terjadi dalam parameter-parameter metode dan
memberikan suatu indikasi dari reliablilitasnya selama penggunaan normal Chan 2004. Robustness atau ketegaran adalah kemampuan untuk
memberikan hasil uji yang sama pada sampel yang sama, tetapi keragaman kondisi pengujian berbeda. Bertujuan untuk mengetahui pengaruh faktor
eksternal terhadap metode sampel dan metode sama, tetapi laboratorium, alat, analis dan waktu pengujian berbeda . Evaluasi terhadap robustness
harus dilakukan selama masa pengembangan metode analisis.
III. BAHAN DAN METODE
