diekstraksi lagi dengan 200 ml bufer fosfat pH 7.5, I:0.05. Campuran supernatan pertama dan kedua ini merupakan ekstrak untuk fraksi protein sarkoplasma.
Kemudian dari endapan pada ekstraksi kedua, dengan perlakuan dan penambahan bahan yang sama diperoleh ekstrak protein miofibril, yaitu melalui
penggabungan antara supernatan ketiga dan keempat. pada ekstraksi protein miofibrilar terdapat perkecualian pada kekuatan ion bufer yang digunakan yaitu
bufer fosfat dengan pH 7.5 kekuatan ion 0.5 melalui penambahan KCl. Diagram alir prosedur ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 4 dibawah ini.
Gambar 4. Ekstraksi Protein Sarkoplasma dan Miofibril Hashimoto et al. 1979
Irisan daging ikan 20 gr
Sentrifuse 4 ºC, 4000 rpm, 25
menit Homogenisasi dengan 200 ml Bufer
posfat pH 7.5, I= 0.05 dan Inhibitor Protease
Pelet Supernatan
Diulang 2x
Homogenisasi dengan 200 ml Bufer KCl-posfat pH 7.5, I= 0.5 dan Inhibitor
Protease Sentrifuse 4
ºC, 4000 rpm, 25 menit
Supernatan Pelet
Penyaringan Protein
Sarkoplasma
Penyaringan Protein Miofibril
Diulang 2x
3.3.3. Analisis Kadar Protein Metode Bradford Bradford 1976
Penentuan kadar protein ekstrak sarkoplasma dan miofibril dilakukan dengan metode Bradford menggunakan serum albumin sapi BSA sebagai
standar. Sampel filtrat ekstrak protein direaksikan dengan pewarna coomasie briliant blue
sebagai komponen utama pereaksi bradford. Pereaksi Bradford dibuat dengan melarutkan 100 mg coomasie briliant blue
G-200 ke dalam 50 ml etanol 95. Kemudian ditambahkan 100 ml asam fosfat 85 wv dan volume akhir larutan dibuat menjadi 1 liter, lalu disaring.
Standar dibuat dengan melarutkan 100 mg serum albumin sapi BSA ke dalam 50 ml air destilata, kemudian diencerkan sampai volumenya mencapai 100
ml konsentrasi 1 mgml. Dari konsentrasi 1 mgml, dibuat satu seri pengenceran larutan standar.
Untuk penetapan protein diperlukan sebanyak 0,1 ml larutan standar dari masing-masing seri konsentrasi, 0,1 ml sampel dan 0,1 ml air destilata sebagai
blanko. Ke dalam masing-masing larutan, ditambahkan 5 ml pereaksi bradford. Setelah didiamkan selama 5 menit, larutan dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang 595 nm. Konsentrasi protein ditentukan berdasarkan kurva standar serum albumin sapi BSA.
3.3.4. Penentuan Karakteristik Ekstrak Protein dengan Elektroforesis SDS- PAGE Laemmli 1970
Elektroforesis SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE dilakukan dengan metode Laemmli 1970, untuk menentukan berat molekul
protein ekstrak protein sampel. Analisis SDS-PAGE dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi separating gel 12 dan stacking gel 5. Sampel
yang dielektroforesis adalah ekstrak protein sarkoplasma dan miofibril hasil ekstraksi dari sampel ikan tongkol, udang jerbung dan kerang hijau. Beberapa
tahapan utama yang harus dilakukan dalam melakukan elektroforesis SDS-PAGE adalah 1 pembuatan separating gel, 2 pembuatan stacking gel, 3 persiapan
sampel, 4 running gel, 5 pewarnaan gel, 6 destaining gel, dan 7 penentuan berat molekul protein-protein yang terpisahkan. Pembuatan larutan stok dan
larutan kerja untuk analisis SDS-PAGE dapat dilihat pada Lampiran 2.
