d. Running SDS-PAGE
Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 70 V. Running dilakukan selama 180
menit sampai migrasi dye tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel
dipindahkan dari elektroda. e.
Pewarnaan gel Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah
berisi pewarna coomasie briliant blue kurang lebih 20 ml. kemudian didiamkan selama 20 menit.
f. Destaining gel
Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan penghilang warna ditambahkan destaining solution dan digoyangkan sekali
hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.
g. Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan
Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker penanda protein dengan logaritma dari berat
molekul marker yang diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein diukur dari garis awal separating gel
sampai ujung pita protein yang dibandingkan dengan jarak migrasi tracking dye
. Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai persamaan berikut : Rf = jarak migrasi protein
jarak migrasi tracking dye
h. Analisis gel elektroforesis
Gel hasil elektroforesis SDS-PAGE tersebut di dokumentasikan dalam bentuk gambar. Hasil dalam bentuk gambar ini kemudian dianalisis densitas pita
proteinnya dengan menggunakan perangkat lunak Image J. Program membaca tebal pita per kolom yang dipilih sebagai kurva berfluktuasi.
3.3.5. Serum Subyek Alergi
Serum dari 20 orang penderita alergi diperoleh melalui wawancara langsung seputar alergi yang diderita subyek meliputi jenis, penyebab, gejala apabila
sedang terkena alergi. Subyek sasaran adalah penderita alergi makanan. Serum satu orang subyek yang normal tidak menderita alergi digunakan sebagai kontrol
negatif. Pengambilan darah dilakukan melalui kooordinasi dengan klinik dengan menggunakan jarum suntik steril syringespuilt 10 cc ml.
Dari ke-21 subyek, 20 ml darah diambil untuk dipisahkan serum dari plasmanya. Darah yang telah diperoleh segera diinkubasi pada suhu 37°C selama
30 menit, lalu disentrifuse selama 20 menit pada kecepatan 2500 rpm. Supernatan yang didapat merupakan serum yang diduga banyak mengandung IgE.
3.3.6. ELISA Ishikawa et al. 1997
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA dilakukan dengan
menggunakan lempeng polistiren dengan 96 sumur. Teknik ini dilakukan berdasarkan metode yang pernah dilakukan Ishikawa et al. 1997 dengan
beberapa modifikasi pada jenis substrat, larutan pemblok dan panjang gelombang pembacaan sesuai dengan jenis subtrat yang digunakan. Konfigurasi ELISA yang
dipilih adalah ELISA tidak langsung yang melibatkan interaksi protein alergen antigen, antibodi primer IgE serum subyek alergi, antibodi sekunder yaitu anti
IgE anti manusia berlabel enzim HRP Horseradish Peroksidase dan substrat TMB 3,3´-tetramethylbenzidine. Formula beberapa larutan untuk uji ELISA
diantaranya seperti coating buffer, blocking buffer dan washing buffer Lampiran 3.
3.3.6.1. Penentuan IgE Total Serum Subyek Alergi kualitatif
Sebanyak 100 µl serum subyek pada pengenceran 1:5 dan 1:10, dilapiskan ke dalam lempeng mikrotiter. Inkubasi dilakukan selama semalam pada suhu
4°C, lalu sisa serum dalam lempeng dibuang dan dilakukan pencucian dengan PBS Tween-20 0.05 5 kali sebanyak 200 µlwell. Kemudian, sebanyak 200 µl
BSA 3 dalam PBS ditambahkan ke dalam lempeng mikrotiter dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. Setelah dicuci sebanyak 5 kali dengan PBS Tween-
20 0.05, dilakukan penambahan dengan antibodi anti IgE manusia berlabel
