3.3.5. Serum Subyek Alergi
Serum dari 20 orang penderita alergi diperoleh melalui wawancara langsung seputar alergi yang diderita subyek meliputi jenis, penyebab, gejala apabila
sedang terkena alergi. Subyek sasaran adalah penderita alergi makanan. Serum satu orang subyek yang normal tidak menderita alergi digunakan sebagai kontrol
negatif. Pengambilan darah dilakukan melalui kooordinasi dengan klinik dengan menggunakan jarum suntik steril syringespuilt 10 cc ml.
Dari ke-21 subyek, 20 ml darah diambil untuk dipisahkan serum dari plasmanya. Darah yang telah diperoleh segera diinkubasi pada suhu 37°C selama
30 menit, lalu disentrifuse selama 20 menit pada kecepatan 2500 rpm. Supernatan yang didapat merupakan serum yang diduga banyak mengandung IgE.
3.3.6. ELISA Ishikawa et al. 1997
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA dilakukan dengan
menggunakan lempeng polistiren dengan 96 sumur. Teknik ini dilakukan berdasarkan metode yang pernah dilakukan Ishikawa et al. 1997 dengan
beberapa modifikasi pada jenis substrat, larutan pemblok dan panjang gelombang pembacaan sesuai dengan jenis subtrat yang digunakan. Konfigurasi ELISA yang
dipilih adalah ELISA tidak langsung yang melibatkan interaksi protein alergen antigen, antibodi primer IgE serum subyek alergi, antibodi sekunder yaitu anti
IgE anti manusia berlabel enzim HRP Horseradish Peroksidase dan substrat TMB 3,3´-tetramethylbenzidine. Formula beberapa larutan untuk uji ELISA
diantaranya seperti coating buffer, blocking buffer dan washing buffer Lampiran 3.
3.3.6.1. Penentuan IgE Total Serum Subyek Alergi kualitatif
Sebanyak 100 µl serum subyek pada pengenceran 1:5 dan 1:10, dilapiskan ke dalam lempeng mikrotiter. Inkubasi dilakukan selama semalam pada suhu
4°C, lalu sisa serum dalam lempeng dibuang dan dilakukan pencucian dengan PBS Tween-20 0.05 5 kali sebanyak 200 µlwell. Kemudian, sebanyak 200 µl
BSA 3 dalam PBS ditambahkan ke dalam lempeng mikrotiter dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. Setelah dicuci sebanyak 5 kali dengan PBS Tween-
20 0.05, dilakukan penambahan dengan antibodi anti IgE manusia berlabel
enzim HRP. Sebelumnya antibodi anti IgE manusia berlabel enzim HRP diencerkan 1:6000 dalam PBS Tween-20 0.05 . Inkubasi dilakukan pada suhu
37°C selama 1 jam. Setelah dicuci dengan PBS Tween-20 0.05 ditambahkan sebanyak 100 µl
substrat TMB dan dibiarkan 5 menit. Kemudian dihentikan reaksinya dengan penambahan 25 µl H
2
SO
4
2N. Hasil reaksi dapat dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm.
3.3.6.2. Penentuan Sifat Alergenisitas Ekstrak Protein
Sebanyak 100 µl ekstrak protein sarkoplasma dan miofibril sampel ikan, udang dan kerang dilarutkan dalam coating buffer konsentrasi 10 µg100µl
dilapiskan pada dasar lempeng mikrotiter. Kemudian diinkubasi pada suhu 4°C selama semalam, lalu dicuci dengan PBS Tween-20 0.05 200 µlwell sebanyak
5 kali. Selanjutnya dilakukan pemblokan dengan larutan BSA 3 dalam PBS sebanyak 200 µlsumur dan diinkubasi selama 1 jam suhu 37°C. Setelah itu dicuci
dengan PBS Tween-20 0.05 sebanyak 5 kali. Serum subyek yang telah diencerkan perbandingan 1:5 atau 1:10 dalam PBS Tween-20, dilapiskan pada
lempeng mikrotiter sebanyak 100 µlsumur. Selanjutnya serum subyek diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C, lalu dicuci sebanyak 5 kali dengan PBS Tween-20
0.05. Penambahan antibodi anti IgE dilakukan setelah mengencerkan 1:6000
dalam PBS Tween-20 0.05. Kemudian sebanyak 100 µlsumur anti IgE manusia berlabel enzim HRP ditambahkan dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C.
Setelah inkubasi, dicuci dengan PBS Tween-20 0.05 sebanyak 5 kali, lalu ditambahkan sebanyak 100 µl substrat TMB dan dibiarkan 5 menit. Kemudian
dihentikan reaksinya dengan penambahan 25 µl H
2
SO
4
2N. Hasil reaksi dapat dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm.
3.3.7. Immunoblotting Towbin et al. 1979
Kategori