34
perlakuan konsentrasi garam KCl dan pH larutan bufer yang digunakan Birkeland dan Bjerkeng 2004.
4.2. Karakteristik Ekstrak Protein dengan Elektroforesis SDS PAGE
Karakterisasi ekstrak protein dengan elektroforesis SDS PAGE bertujuan untuk mengetahui protein-protein penyusun daging sampel yaitu udang jerbung,
ikan tongkol dan kerang hijau. Ekstrak protein baik sarkoplasma dan miofibril yang akan dianalisis dengan elektroforesis terlebih dahulu dihitung kadar
proteinnya dengan metode Bradford. Hal ini bertujuan agar konsentrasi sampel tidak kurang dari batas deteksi pewarna yang digunakan batas deteksi coomassie
briliant blue = 0.1µg Bollag dan Edelstain 1991. Dengan diketahui kadar
protein masing-masing sampel, maka jumlah protein yang akan diinjeksikan ke dalam mini slab elektroforesis dapat dibuat sama.
Elektroforesis memiliki peranan penting dalam pemisahan molekul-molekul biologi, khususnya protein. Elektroforesis juga sangat sensitif terhadap perbedaan
muatan dan berat molekul yang cukup kecil Bachrudin 1999. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan dua jenis gel, yaitu gel penahan stacking gel
dan gel pemisah separating gel. Gel penahan dibuat dengan konsentrasi gel 4 yang memiliki ukuran pori lebih besar dan pH lebih kecil 6.8. Sementara gel
pemisah dibuat dengan konsentrasi gel 12 yang mempunyai ukuran pori lebih kecil dan pH lebih besar 8.8. Pemilihan konsentrasi gel ini tergantung pada
kisaran berat molekul protein yang akan dipisahkan. Semakin besar ukuran pori- pori gel konsentrasi gel yang rendah maka semakin besar molekul protein yang
dapat bermigrasi. Gel penahan dibuat dengan ukuran pori lebih besar dengan kekuatan ion yang lebih kecil, sehingga mempercepat pergerakan molekul karena
tahanan friksi yang rendah. Protein yang akan dipisahkan dilarutkan dalam bufer yang mengandung
SDS Sodium Dodesil Sulfat dan 2-merkaptoetanol. Penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan pemanasan akan memecah struktur tiga dimensi
protein, terutama ikatan disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual. SDS akan membungkus rantai protein yang tidak terikat membentuk
kompleks SDS-protein yang bermuatan negatif. Kemudian kompleks SDS-protein ini dialirkan dalam medium yang mengandung medan listrik sehingga senyawa
protein yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah elektroda yang polaritasnya berlawanan dengan molekul protein. Kompleks SDS-protein yang lebih besar
mempunyai mobilitas yang lebih rendah dengan kompleks yang lebih lebih kecil. Hal tersebut disebabkan oleh kerapatan partikel gel yang menghambat mobilitas
protein. Prinsip inilah yang digunakan untuk memisahkan molekul-molekul dengan muatan berbeda Wijaya dan Rohman 2001. Berikut adalah berturut-turut
dari atas ke bawah subunit protein dari berbobot molekul terbesar sampai terkecil, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5.
Gambar 5. Pola elektroforesis fraksi protein. M: low-molecular- weight protein marker
, 1: sarkoplasma tongkol, 2: miofibril tongkol, 3: sarkoplasma kerang hijau, 4: miofibril kerang
hijau, 5: sarkoplasma udang jerbung, 6: miofibril udang jerbung
Pita-pita yang terbentuk pada gel pemisah diidentifikasi dengan pewarnaan gel menggunakan larutan coomasie blue dalam asam asetat glasial dan metanol.
Asam asetat glasial digunakan untuk fiksasi protein yang berguna untuk mengendapkan dan mengimobilisasi protein sehingga warna yang terbentuk
permanen. Selanjutnya penentuan berat molekul masing-masing pita protein dihitung berdasarkan kurva standar marker Lampiran 8a, yang diperoleh melalui
hubungan antara mobilitas relatif Rf dengan nilai logaritma berat molekul Log BM protein marker. Nilai mobilitas relatif Rf, logaritma berat molekul Log
BM dan berat molekul protein standar dapat dilihat pada Tabel 3.
36
Tabel 3 menunjukkan Marker yang digunakan sebagai standar protein terdiri atas protein-protein dengan berat molekul kecil Low Molecular Weight.
Marker Fermentas tersebut mengandung tujuh jenis protein standar yang sudah
diketahui berat molekulnya, yaitu β-galactosidase BM: 116 kDa, bovine serum
albumin BM: 66.2 kDa, ovalbumin BM: 45 kDa, lactate dehydrogenase BM: 35 kDa, REase BSP 981 BM: 25 kDa,
β-lactoglobulin BM: 18.4 kDa dan lysozime BM: 14.4 kDa.
Tabel 3. Nilai mobilitas relatif Rf, logaritma berat molekul Log BM dan berat molekul protein standar
Pita ke-
Jenis protein BM
kDa Log BM
Jarak pergerakan
cm Rf
1 β-galactosidase 116
2.0645 1.81
0.157 2 BSA
66.2 1.8209 3.4
0.296 3 Ovalbumin
45 1.6532 5.41
0.470 4 Lactate
dehydrogenase 35 1.5441 6.92
0.602 5 Rease
Bsp981 25 1.3979
8.86 0.770
6 β-lactoglobulin 18.4
1.2648 10.47
0.910 7 Lysozyme
14.4 1.1584 10.97 0.954
Analisis data protein standar dilakukan dengan regresi linier, dimana dari hubungan antara logaritma berat molekul sumbu Y dan mobilitas relatif sumbu
X diperoleh persamaan Y= 2.1739-1.0369X dengan R
2
= 0.9858. Persamaan regresi dari kurva linier standar tersebut digunakan untuk menghitung berat
molekul protein-protein yang berhasil dipisahkan dari ekstrak fraksi protein udang jerbung, ikan tongkol dan kerang hijau.
Hasil pemisahan protein sampel secara keseluruhan Gambar 5 menunjukkan bahwa pita protein yang muncul pada gel elektroforesis memiliki
jumlah dan ketebalan yang berbeda-beda. Pita protein yang muncul lebih banyak dan lebih tebal pada fraksi sarkoplasma dibandingkan dengan fraksi miofibril.
Terutama terlihat pada fraksi sarkoplasma udang jerbung dan ikan tongkol. Hal ini sesuai dengan uji kadar protein fraksi tersebut, yang menunjukkan bahwa kadar
protein fraksi sarkoplasma sampel lebih tinggi dibandingkan dengan kadar protein fraksi miofibril.
Pita-pita protein yang dihasilkan dari elektroforesis kemudian dianalisis densitasnya dengan menggunakan program Image J, sehingga menghasilkan
Kategori