Gambar 12. Hasil uji ELISA protein kerang hijau terhadap 20 serum subyek A-T Afraksi sarkoplasma; Bfraksi miofibril
Berdasarkan data hasil wawancara riwayat alergi masing-masing subyek Tabel 4, subyek G dan K diketahui memiliki alergi terhadap kerang. Hasil uji
ELISA ekstrak protein kerang hijau terhadap kedua serum subyek tersebut menunjukkan bahwa ekstrak protein kerang hijau memang bersifat alergenik
terhadap dua serum subyek G dan K. Fraksi sarkoplasma kerang hijau bersifat alergenik pada serum subyek G, sedangkan fraksi miofibril bersifat alergenik
terhadap serum subyek K. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kedua fraksi ekstrak protein kerang hijau mengandung komponen protein alergen, sehingga untuk
penggunaan ekstrak sebagai isolat alergen dapat dilakukan dengan mengekstrak protein secara keseluruhan. Hal ini juga ditunjang dari segi praktis
penggunaannya, karena dalam konsumsi sehari-hari belum ditemukan pemisahan kedua fraksi protein tersebut.
52
4.3.2.3. Udang Jerbung
Penentuan alergenisitas protein sarkoplasma dan miofibril udang jerbung didasarkan pada nilai absorbansi interaksi antigen ekstrak protein dengan IgE
serum pengenceran 1:10 dapat dilihat pada Gambar 13. Dimana dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa alergenisitas protein udang berbeda pada serum subyek
yang berbeda. Perbedaan alergenisitas protein udang ini pada beberapa subyek dapat disebabkan oleh sifat dari IgE masing-masing subyek. Menurut Bellanti
1993, daerah antibodi aktif molekul imunoglobulin ditentukan oleh rangkaian asam amino. Individu yang berbeda akan mempunyai IgE yang berbeda
tergantung pada antigen mana yang dapat mensensitisasi sel plasma pembentuk antibodi. Dengan demikian akan memiliki daerah antibodi aktif yang berbeda,
sehingga hanya antigen protein alergen yang mempunyai sisi aktif yang sama yang dapat bereaksi dengan IgE tersebut.
Gambar 13. Hasil uji ELISA protein udang jerbung terhadap 20 serum subyek A-T Afraksi sarkoplasma; Bfraksi miofibril
A
Dari hasil uji ELISA Gambar 13 menunjukkan bahwa dari 20 subyek yang diuji hanya 7 subyek yang memberikan hasil positif alergi terhadap kedua fraksi
protein udang jerbung sarkoplasma dan miofibril yaitu subyek A, B, E, H, L, N dan subyek P. Alergenisitas protein udang paling kuat terlihat pada subyek L yang
terlihat dari rata-rata nilai absorbansi yang lebih tinggi dibanding subyek lainnya. Nilai absorbansi interaksi protein miofibril dengan IgE serum subyek L lebih
tinggi OD= 1.681 daripada fraksi protein sarkoplasma OD= 0.935. Semakin besar nilai absorbansi berarti semakin banyak kompleks yang terbentuk.
Sementara kompleks yang terbentuk menunjukkan kandungan IgE dalam serum yang bereaksi dengan protein udang, baik fraksi sarkoplasma maupun miofibril.
Zakaria et al.1998 dengan metode ELISA melaporkan bahwa ekstrak protein sarkoplasma dan miofibril udang putih juga dapat berinteraksi dengan IgE serum
subyek alergi, dimana protein miofibril lebih bersifat alergenik. Data hasil ELISA alergenisitas protein udang jerbung secara lengkap disajikan pada Lampiran 10a.
Selain itu dapat diketahui juga bahwa 5 serum subyek G, I, J, O, dan R memberikan hasil negatif terhadap uji alergenisitas kedua fraksi protein udang
jerbung. Hal ini menunjukkan bahwa tidak adanya reaktivitas IgE serum tersebut terhadap protein kedua fraksi udang. Hasil uji penentuan total IgE menunjukkan
bahwa serum keenam subyek tersebut memiliki kandungan IgE yang lebih tinggi dibandingkan serum subyek normal. Bellanti 1993 menyatakan bahwa IgE
setiap individu memiliki sisi pengikatan yang berbeda, sehingga hanya antigen yang memiliki sisi pengikatan sesuai dengan antibodi yang dapat beraksi
dengannya. Hal ini juga yang menjelaskan terjadinya perbedaan alergenisitas protein sarkoplasma dan miofibril udang pada subyek C, F, Q dan subyek D, K,
M, S, T. Dimana serum tiga subyek C, F, Q memberikan hasil positif terhadap protein sarkoplasma udang dan lima serum D, K, M, S, T yang memberikan
hasil positif terhadap protein miofibril udang. Yuliarni 1998 dengan metode yang sama melaporkan bahwa ekstrak protein sarkoplasma dan miofibril udang
windu juga dapat berinteraksi dengan IgE serum subyek alergi. Jenis protein yang bersifat alergenik yang diidentifikasi dalam fraksi miofibril udang adalah
tropomiosin yang memiliki berat molekul 34-38 kDa Lehrer et al. 2003, arginin
54
kinase 40 kDa Yu et al. 2003, sarcoplasmic calcium binding protein SCP dan myosin light-chain
Ayuso et al. 2008.
4.4. Profil Protein Alergenik Ekstrak Protein Sarkoplasma dan Miofibril dengan Metode
Immunoblotting
Tujuan immunoblotting dalam penelitian ini adalah untuk mengetahui jenis protein alergen dalam masing-masing ekstrak sampel yang dapat memicu alergi
pada individu yang berbeda. Metode immunoblotting digunakan untuk melihat interaksi antara antigen protein alergen dan antibodi, sehingga dapat diketahui
protein dengan berat molekul tertentu yang bersifat alergenik dari fraksi sarkoplasma maupun miofibril udang jerbung, ikan tongkol dan kerang hijau.
Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya kompleks protein dengan antibodi IgE yang berwarna coklat pada membran nitroselulosa. Hal tersebut
menunjukkan bahwa protein yang terikat secara spesifik dengan antibodi IgE dalam serum penderita alergi adalah protein alergen.
Teknik immunoblotting dilakukan dengan mentransfer pita protein pada gel SDS PAGE ke membran nitroselulosa. Marck 1995 menyatakan bahwa
nitroselulosa merupakan membran yang paling umum digunakan untuk blotting. Membran ini mempunyai kapasitas mengikat protein sebesar 80 µgcm
2
. Ukuran pori yang digunakan adalah 0.45 µm, dengan ukuran pori yang kecil ini
diharapkan jumlah protein yang hilang pada saat transfer kecil. Untuk meningkatkan efisiensi pengikatan protein yang didenaturasi pada
membran nitroselulosa, ditambahkan metanol 20 ke dalam bufer transfer. Proses transfer terjadi selama 1,5 jam pada tegangan 90 volt. Voltase yang terlalu tinggi
pada proses transfer dapat menyebabkan kerusakan sampel karena meningkatnya panas dalam sistem. Setelah proses transfer selesai, membran nitroselulose
kemudian diblok dengan susu skim 5 untuk menutupi seluruh membran yang tidak terikat protein, sehingga terjadinya pengikatan non spesifik dapat dihindari.
Serum yang digunakan dalam uji immunoblotting yaitu serum subyek A, B, H, L dan P. Serum yang mengandung IgE spesifik ini kemudian ditambahkan ke
membran dan diinkubasi selama 1 jam dan dicuci dengan PBST selama 3 kali. Pencucian berguna untuk menghilangkan SDS dari protein sehingga protein yang
terdenaturasi oleh SDS dapat kembali ke struktur semula. Selanjutnya dilakukan
