Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut
41
Table 5. Primer yang Digunakan pada Uji Megalocytivirus
Amplifikasi Sequence Primer
Target Produk PCR
First F: C1105 5’- GGGTTCATCGACATCTCCGCG - 3’
430 bp F: C1106 5’- AGGTCGCTGCGCATGCCAATC - 3’
Nested F: C1073 5’- AATGCCGTGACCTACTTTGC - 3’
167 bp R: C1074 5’- GATCTTAACACGCAGCCACA - 3’
3. Prosedur Kerja
Ekstraksi DNA
- Keringkan spesimen menggunakan tissue steril.
- Timbang sejumlah 20 miligram.
- Masukkan ke dalam tabung mikro steril berukuran 1,5 ml, lalu beri
600 μl reagen DTAB. -
Haluskan spesimen menggunakan pestle. -
Inkubasi pada 75
o
C selama 5 menit. Setelah selesai dinginkan tabung mikro sampai suhu ruang.
- Tambahkan 700 mikroliter kloroform ke dalam tabung mikro.
- Vorteks selama 10 detik.
- Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 5 menit.
- Pindahkan cairan bening yang terdapat di bagian atas tabung
mikro ke dalam tabung mikro yang baru. -
Tambahkan 100 μl reagen CTAB dan 900 μl dd. H
2
O ke dalam tabung mikro yang baru poin 9.
- Vorteks selama 10 detik.
- Inkubasi pada 75
o
C selama 5 menit. Setelah selesai, turunkan suhu tabung sampai suhu ruang.
- Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 10 menit.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut
42
- Buang supernatan dengan hati-hati agar pelet tidak ikut
terbuang. -
Larutkan pelet menggunakan 150 μl reagen Dissolve Solution. -
Inkubasi pada 75
o
C selama 5 menit. Setelah selesai, turunkan suhu tabung mikro sampai suhu ruang.
- Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 5 menit.
- Pindahkan cairan bening di bagian atas tabung mikro ke dalam
tabung mikro yang baru. -
Tambahkan 300 µl Ethanol PA 95. -
Vorteks selama 10 detik. -
Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 5 menit. -
Buang supernatan, lalu keringkan pelet dengan cara membalik tabung di atas kertas tissue steril.
- Tambahkan TE Buffer sebanyak 100 µl
- Simpan pada suhu -20
C sampai akan digunakan dalam amplifikasi.
Dapat menggunakan ekstrasi DNA lainnya.
3.1. First Step
- Buat master mix berisi campuran primer C1105F, C1106 R,
Go Taq Green, NFW ditambah 2 kontrol +- untuk first step. -
Beri label pada microtube 0.2 ml sesuai dengan kebutuhan sampel dan kontrol.
- Siapkan volume master mix n+1, n= jumlah reaksi lebih
banyak dari volume yang dibutuhkan dengan formulasi. Komposisi reagen untuk setiap proses amplifikasi dapat di
lihat pada tabel di bawah ini :
