Etika Penelitian METODE PENELITIAN

36

3.7. Etika Penelitian

Dijelaskan bahwa penelitian yang akan dilaksanakan telah mendapat persetujuan dari Komite Etik Bidang Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan. 3.8.Bahan dan cara 3.8.1.Pengambilan sampel Untuk sampel darah diambil dari darah vena. 3.8.2.Pengambilan sampel darah Pengambilan sampel darah diambil dari darah vena mediana cubiti.Tempat punksi vena terlebih dahulu dilakukan aseptik dengan alkohol 70 dan dibiarkan dibiarkan kering,kemudian dilakukan punksi. Pengambilan darah dilakukan tanpa stasis yang berlebihan dengan disposable syringe 10 cc,darah diambil 10 cc dengan antikoagulan : 3 cc untuk Hb Elektroforesis + EDTA, 4 cc untuk pemeriksaan feritin + heparin. 3.8.3.Pengolahan sampel 1. Darah lengkap : segera diperiksa dengan menggunakan Sysmexz 2000 2. Feritin : darah dibiarkan dalam suhu kamar selama 30 menit,kemudian Sentrifus dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit, Tabung tersebut dimasukkan ke dalam untuk diukur dengan Cobas e 601 Universitas Sumatera Utara 37 3.Hb Elektroforese : Sampel darah untuk pemeriksaan HbE adalah hemolisat Pembuatan hemolisat : - Sentrifuge 3-5 ml darah EDTA 3000 rpm selama 15 menit,lapisan plasma dibuang. - Cucilah eritrosit dengan NaCl 0,9 sama banyak sebanyak 3 kali. - Tambahkan 1 bagian eritrosit dengan 2 bagian air suling dan 1 bagian karbon tetraklorida. - Kocok selama 5 menit dan sentrifuge 3000 rpm selama 30 menit. - Pisahkan hemolisat dan kemudian disaring.Hemolisat ini dapat disimpan pada suhu -20 C, tahan selama 3 bulan. 3.8.4.Pemeriksaan laboratorium Prinsip kerja flowsitometri :

1. Pemeriksaan darah lengkap dengan metode flowsitometri.

Prinsip light scattering adalah metode dimana sel didalam suatu aliran melalui celah dimana berkas cahaya difokuskan ke arah itu atau sensing area. Apabila cahaya itu mengenai sel,akan dihamburkan,dipantulkan atau dibiaskan ke semua arah. Beberapa detektor yang diletakkan pada sudut-sudut tertentu akan menangkap berkas-berkas sinar sesudah melewati sel itu. Universitas Sumatera Utara 38 Pulsa cahaya yang berasal dari hamburan cahaya,intensitas warna atau flouresensi diubah pula menjadi pulsa listrik. Pulsa ini oleh program komputer dipakai untuk menghitung jumlah,ukuran maupun isi bagian dalam yang merupakan ciri dari masing-masing sel. Hamburan cahaya dengan arah lurus atau forward scattered light akan mendeteksi volume dan ukuran sel. Sedangkan yang dibiaskan dengan sudut 90 atau right angle scatterd light menunjukkan isi granula sitoplasma. Pemeriksaan feritin dengan menggunakan Cobas e 601 berdasarkan metode ELISA yaitu electrochemiluminescence immunoassay ECLIA. Pada inkubasi yang pertama,serum yang mengandung feritin ditambahkan dengan antibodi monoklonal terhadap feritin berasal dari tikus yang dilekatkan pada biotin. Setelah itu ditambahkan antibodi monoklonal terhadap feritin dari tikus yang telah dilabel dengan ruthenium sehingga terbentuk kompleks sandwich. Pada inkubasi kedua ditambahkan streptavidin yang dilapisi mikropartikel,bagian streptavidin akan melekat ke biotin. Kemudian mikropartikel akan melekat ke permukaan elektroda membentuk kompleks mikropartikel dan menimbulkan emisi chemiluminescent yang akan diukur dengan photomultiplier.Lamanya pemeriksaan 18 menit pada suhu 37

2. Pemeriksaan feritin dengan metode ECLIA

C. Universitas Sumatera Utara 39 Sistem minicap menggunakan prinsip elektroforesis kapiler dalam larutan bebas dengan molekul bermuatan dipisahkan berdasarkan mobilitas elektroforeis pada larutan buffer alkali dengan pH alkalis. Kecepatan migrasi tergantung aliran elektroosmotik yang bergerak menuju katoda,menyebabkan aliran buffer dari anoda ke katoda. Seluruh ion baik positif maupun negatif didorong ke arah yang sama oleh aliran elektroosmotik dan analit terpisah sesuai mobilitas elektroforesis saat bermigrasi melewati kapiler. Pada saat ini terjadi konflik antara aliran elekroosmotik dengan mobilitas elektroforesis,sehingga ion yang bermuatan negatif akan bermigrasi lebih lama dibandingkan dengan ion yang bermuatan positif. 3.Pemeriksaan Hb Elektroforesis dengan metode mikrokapiler elektroforesis Sistem MINICAP memiliki fungsi kapiler paralel yang memungkinkan dilakukannya 2 analisi kuantifikasi hemoglobin secara bersamaan. Bahan pemeriksaan yang diencerkan dengan larutan hemolisa diaspirasi pada ujung anoda kapiler. Kemudian dijalankan voltase tinggi untuk pemeriksaan fraksi hemoglobin. Hemoglobin dipisahkan dalam kapiler silika yang langsung dan spesifik dideteksi pada panjang gelombang 415 nm. Deteksi langsung pada panjang gelombang yang tepat meningkatkan ketelitian dan ketepatan serta memastikan hasil yang tetap. Hasil elektrogram dievaluasi secara visual untuk melihat pola akurat terhadap fraksi hemoglobin. 28 28 Universitas Sumatera Utara 40 Cara : • Alat dalam keadaan ready dan menu pemeriksaan hemoglobin elektroforesis. • Keluarkan kontrol dari lemari es tunggu hingga sama dengan suhu ruangan. • Buka pintu MINICAP kemudian letakkan kontrol pada posisi tabung 28 dan larutan pelisis pada posisi tabung 27. • Tutuplah pintu MINICAP ,alat secara otomatis melakukan pemeriksaan. • Masukkan data kontrol,meliputi nomor lot reagen dan tanggal kadaluarsa. • Hasil dapat dilihat pada result eksplorer dan dapat dicetak. Sampel dikumpulkan untuk satu minggu ,hingga akan dilakukan pemeriksaan hemoglobin elektroforese, sehingga kualiti kontrol untuk pemeriksaan elektroforese juga dilakukan satu kali dalam satu minggu. 3.8.5.Kontrol kualitas pemeriksaan laboratorium 3.8.5.a. kontrol kualitas pemeriksaan darah lengkap Sysmex XT 2000i Untuk pemeriksaan darah lengkap Sysmex XT 2000i digunakan regen kualitas kontrol e-check Trilevel Quality Control. Darah manusia yang digunakan dalam Sysmex e-check bebas dari HbsAg dan tidak mengandung antibodi HIV-1,HIV-2 dan Hepatitis virus C dengan menggunakan FDA teknik specifik.Sysmex e-check harus dianggap berpotensi menular dan harus ditangani dengan menggunakan standar pencegahan . Prosedur analisa kualitas kontrol 1. Keluarkan vial e-Check dari kulkas dan biarkan di suhu ruangan 18-25 2. Campur vial dengan perlahan end to end iinversion sampai benar-benar tercamour homogen. C selama±15 menit. a. Tempatkan pada suhu ruangan ,campur vial-vial kontrol di rak deengan label barcode yang menghadap ke instrumen. b. Klik “ Sampler” kemudian “Sampler Start” dari kotak dialog dan OK Universitas Sumatera Utara 41 c. Setelah kontrol dianalisa,klikn ikon “QC” di IPU. I. Klik pada tab kontrol untuk menampilkan grafik L-J II. Klik pada ∇ diasamping Level, dan pilih tingkat 1-3 III. Klik pada ∇ disamping mode ,dan pilih “ Closed” IV. Klik pada ∇ disamping Lot dan pilih “New” atau “Current”. V. Gunakan scroll bar disebelah kanan grafik untuk melihat semua parameter grafik. VI. Pastikan semua parameter berada dalam batas-batas yang ditentukan laboratorium . VII. Verifikasi hasil auto mode QC SF-2000i. Kontrol kualitas pemeriksaan RBC Sysmex XT 2000i Bulan Level 1 Level 2 Level 3 Oktober UL : 2.39 Target:2.28 LL :2.17 SD :0.021 Mean :2.30 CV :0.9 UL :4.58 Target :4.36 LL : 4.14 SD : 0.032 Mean : 4.42 Cv : 0.7 UL : 5.50 Target : 5.32 LL : 5.07 SD : 0.032 Mean : 5.38 CV : 0.7 Nopember UL : 2.39 Target :2.28 LL :2.17 SD :0.021 Mean :2.30 CV :0.9 UL :4.58 Target :4.36 LL : 4.14 SD : 0.032 Mean : 4.42 Cv : 0.7 UL : 5.50 Target : 5.32 LL : 5.07 SD : 0.032 Mean : 5.38 CV : 0.7 Desember UL :2.42 Target :2.30 LL : 2.18 SD : 0.022 Mean : 2.33 CV : 0.9 UL : 4.53 Target :4.31 LL :4.09 SD : 0.025 Mean : 4.36 CV : 0.6 UL : 5.62 Target :5.35 LL : 5.08 SD : 0.034 Mean : 5.43 Cv : 0.6 Universitas Sumatera Utara 42 Kontrol kualitas pemeriksaan Hemoglobin Sysmex XT 2000i Bulan Level 1 Level 2 Level 3 Oktober UL : 5.8 Target :5.6 LL :5.4 SD :0.08 Mean :5.7 CV :1.4 UL : 12.5 Target : 12.1 LL : 11.7 SD : 0.09 Mean : 12.3 CV : 0.7 UL : 17.5 Target : 16.8 LL : 16.2 SD : 0.12 Mean : 16.7 CV : 0.7 Nopember UL : 5.8 Target :5.6 LL :5.4 SD :0.08 Mean :5.7 CV :1.4 UL :12.5 Target :12.1 LL :11.7 SD : 0.09 Mean : 12.3 CV : 0.7 UL : 17.5 Target : 16.8 LL : 16.2 SD : 0.12 Mean : 16.7 CV : 0.7 Desember UL : 6.0 Target : 5.8 LL : 5.6 SD : 0.10 Mean : 5.9 CV : 1.7 UL : 12.6 Target : 12.2 LL :11.8 SD : 0.08 Mean :12.3 CV : 0.7 UL : 17.0 Target :16.5 LL : 16.0 SD : 0.14 Mean : 16.6 CV : 0.8 Kontrol kualitas pemeriksaan MCV Sysmex XT 2000i Bulan Level 1 Level 2 Level 3 Oktober UL : 79.5 Target : 75.7 LL : 71.9 SD : 0.66 Mean : 76.0 CV : 0.9 UL : 86.3 Target : 82.2 LL : 78.1 SD : 0.60 Mean : 82.9 CV : 0.7 UL : 94.5 Target : 89.8 LL : 85.5 SD : 0.52 Mean : 90.8 CV : 0.7 Nopember UL : 79.5 Target : 75.7 LL : 71.9 SD : 0.66 Mean : 76.0 CV : 0.9 UL : 86.3 Target : 82.2 LL : 78.1 SD : 0.60 Mean : 82.9 CV : 0.7 UL : 94.5 Target : 89.8 LL : 85.5 SD : 0.52 Mean : 90.8 CV : 0.7 Desember UL : 81.2 Target :77.3 LL : 73.4 SD : 0.68 Mean : 78.1 CV : 0.9 UL : 87.7 Target :83.5 LL :79.3 SD : 0.56 Mean : 84.5 CV : 0.7 UL : 94.0 Target :89.5 LL : 85.0 SD : 0.51 Mean : 90.7 CV : 0.6 Universitas Sumatera Utara 43 3.8.5.b.Kontrol kualitas pemeriksaan feritin dengan metode ECLIA Cobas e 601 Untuk kualiti kontrol dapat dugunakan Elecsys PreciControl Anemia 1 19,4ngml,2 234 ngml,dan 3 1446 ngml atau Elycsys PreciControl Tumor Marker 1 22,2 ngml dan 2 226 ngml .Materi kontrol yang lain yang sesuai juga dapat digunakan. Kontrol untuk range variasi konsentrasi harus ditetapkan penentuannya,paling tidak setiap 24 jam ketika tes akan dimulai,satu untuk satu kit reagent dan sesudah setiap kalibrasi. Interval dari kontrol dan batasannya disesuaikan untuk setiap laboratorium. Dibuat pembatasan penilaian yang rendah diantara limit tertentu. Setiap laboratorium harus membuat pemeriksaan yang baik jika nilanya terlalu rendah. Mengikuti ketetapan pemerintah dan pedoman setempat untuk kualiti kontrol. Pemeriksaan Feritin dilakukan sekaligus dalam satu hari, sehingga pemantapan kualitas hanya sekali dengan hasil sebagai berikut : Pemeriksaan 1 Tanggal 22-01-2013 Level 1 Target 9.73 ngmL Level 2 Target 305.0 ngmL 3.8.5.c.Kontrol kualitas Hemoglobin Elektroforesis Pemantapan kualitas laboratorium yang baik harus dilakukan untuk mendapatkan hasil pemeriksaan laboratorium yang benar. Kontrol positif dan kontrol negatif harus dilakukan secara paralel dengan spesimen yang berasal dari pasien. Kegagalan untuk mendapatkan hasil yang tepat untuk nilai kontrol menunjukkan indikasi kesalahan dari pada reagen yang digunakan: Universitas Sumatera Utara 44 = uji ketelitian dan ketepatan pemeriksaan kadar HbA2 menggunakan bahan kontrol Normal. Digunakan kontrol Normal HbA2 SEBIA,cat:PN 4778 Dengan rentang nilai 2,1-3,1. = uji ketelitian dan ketepatan kadar HbF menggunakan bahan kontrol A,F.S.C.Bahan Kontrol A,F,S,C SEBIA,cat: PN 4792 dengan rentang nilai untuk HbF 19,5-25,5 = uji ketelitian pemeriksaan kadar HbA2 dan HbF menggunakan bahan pemeriksaan Darah orang dewasa normal. = uji ketelitian pemeriksaan kadar HbF menggunakan bahan darah tali pusat Pemantapan kualitas pemeriksaan Hb A2 dengan Mikrokapiler Elektroforesis Bulan Kontrol 1 Kontrol 2 Oktober 3.0 2.9 Nopember 2.9 3.0 Desember 2.8 2.9

3.9. IDENTIFIKASI VARIABEL