1. 2. Analisis Proksimat dan Kadar Amilosa

3. 3.1.Tahap I: Pembuatan RS3 dan Pemanfaatannya sebagai Substrat Fermentasi 3. 3. 1. 1. Produksi RS3 Pati beras diekstrak dengan larutan alkali Wang Wang 2004. Tata cara ekstraksi adalah sebagai berikut: tepung beras ditambah dengan larutan NaOH 0,1, 1 L, diaduk terus-menerus selama 1 jam kemudian disaring dengan 2 lapis kain saring. Filtrat dikumpulkan, disentrifugasi 1500 g,4 o C selama 7 menit. Supernatan dibuang, endapan bagian atas protein dipisahkan dari endapan bagian bawah pati. Fraksi pati ditambah NaOH 0,1 1 L kemudian diperlakukan dengan cara yang sama. Fraksi pati disuspensikan dengan akuades 250 mL kemudian dinetralkan dengan HCl 1 M dan disentrifugasi. Endapan dibilas satu kali lagi dengan cara yang sama kemudian endapan pati dikeringkan di dalam oven 40 o Pati beras atau sagu diproses menjadi RS3 mengikuti cara yang diuraikan oleh Kim et al. 2003dengan sedikit modifikasi. Secara ringkas prosedurnya adalah sebagai berikut: pati 50 g disuspensikan dalam 200 mL akuades, dipanaskan 100 C selama kurang lebih 18 jam. Pati digiling halus kemudian disimpan hingga digunakan. Sedangkan pati sagu hanya dicuci ulang tiga kali dan dikeringkan kemudian disimpan hingga digunakan. o C, 10 menit, diautoklaf 121 o C, 15 Psi, 1jam dan disimpan pada suhu 4 o C selama 12-14 jam untuk menginduksi retrogradasi. Pati retrogradasi disuspensikan dalam 1 L akuades dan dihidrolisis dengan enzim. Perlakuan berikut diterapkan pada pati sagu maupun pati beras: a 10 6 unitamilaseg substrat, 1 jam, 85 o C, b 4500 unit pululanaseg substrat , 3 jam, 55 o C, c 10 6 amilaseg substrat, 1 jam, 85 o C dilan- jutkan dengan 4500 unit pululanaseg substrat, 3 jam, 55 o C. Hidrolisat dipisahkan dengan bantuan sentrifugasi 1500 g, endapan dikumpulkan dan disimpan pada suhu 10 o C selama 16-18 jam. Endapan disuspensikan dalam akuades dan dihomogenkan kemudian dikeringkan dengan pengering semprot yang memiliki suhu inlet 160 o C. 3. 3. 1. 2. Analisis Proksimat dan Kadar Amilosa Kadar air, abu, protein dan mineral di dalam pati sagu dan beras dianalisis dengan metode standar AOAC 2006, sedangkan kadar amilosa pati dianalisis menggunakan metoda kolorimeteri Juliano 1971.

3.3.1.3. Analisis Kadar RS

Kadar RS3 dianalisis menurut metoda Goni et al. 1996. Contoh 50 mg didispersikan di dalam 5 ml larutan KCl-HCl pH 1,5 dan diinkubasi dengan 4400 unit larutan pepsin pada suhu 40 o Bufer tris maleat 0,1 MpH 6.9 4.5 mL ditambahkan ke dalam campuran con- toh dan diinkubasi dengan amilase 100 unit selama 16 jam pada suhu 37 C selama 1 jam untuk menghilangkan protein. o C untuk menghidrolisis pati tercerna. Contoh kemudian disentrifugasi 1000 g, 15 menit sebanyak dua kali. Supernatan dibuang sedangkan endapan dibasahi dengan 1,5 mLakuades dan dilarutkan dengan 1,5 mL KOH 4M. Larutan RS dicampur dengan 2 M HCl dan bufer sodium asetat 0,4M pH 4,75, kemudian diinkubasi dengan 100 unitlarutan amiloglukosidase pada 55 o C selama 45 menit. Contoh disentrifugasi 1000 g selama 15 menit dan supernatannya dikumpulkan. Glukosa dalam supernatan diukur dengan metoda phenol-asam sulfat Dubois et al. 1956. RS dihitung sebagai glukosa x 0,9 dan dinyatakan dalam persen terhadap berat contoh awal.

3.3.1.4. Fermentasi in vitro

Bakteri keadaan liofilisasi diaktifkan. SelanjutnyaC. butyricumBCC B2571 dipelihara dalam mediaReinforced Clostridia Media RCM, dan E. rectaleDSM 17629 dalam mediaPeptone Yeast-extract Glucose PYG Lampiran 2. Kultur disegarkan secara berkala. Botol serum diisi 20 ml media RCM atau PYG dengan sumber karbon berupa 1 RS3 dan 0,5 glukosa. Botol ditutup dengan septum karet kemudian disterilkan 121 o C, 15 menit. Media diinokulasi dengan kultur stok 10 9 kolonimL dan berada pada fase log dibawah aliran gas CO 2 , diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam. Fermentasi in vitro dengan sumber karbon glukosa 1,5 juga dikerjakan.Pada akhir fermentasi, sel bakteri dipisahkan dengan sentrifugasi dan supernatan dikumpulkan.

3.3.1.5. Pengukuran Aktivitas Amilolitik pada Media Berpati

Degradasi pati oleh C.butyricum BCC B2571 atau E.rectale DSM 17629 diketahui dengan mengukur luas zona bening pada cawan agar yang disuplementasi dengan RS3 0,2. C.butyricum BCC B2571 atau E.rectale DSM 17629 30 µ L ditransfer ke dalam “sumur” yang ada pada cawan agar. Cawan kemudian diinkubasi di dalam anaerobic jar pada 37 o C selama 48 jam. Zona bening visualisasi dengan meneteskan larutan I 2 -KI kemudian luasnya diukur.

3.3.1.6. Pengukuran Gas dan pH

Gas yang dihasilkan di dalam botol fermentasi diukur volumenya dengan cara mengalirkan gas ke dalam syringe. Alat pH meter digunakan untuk mengukur pH media pada akhir fermentasi.

3.3.1.7. Analisis Asetat, Propionat dan Butirat

Media fermentasi disentrifugasi 3000 g selama 10 menit. Supernatan disaring dengan membran 0, 22 μm. Contoh 1μldiinjeksikan ke instrumen khromatografi gas Agilent Technologist, 7890A GC System yang dilengkapi dengan flame ionization detectorFID dan kolom HP Innowax 19091-136 coloum 60 m x 0.250 mm. Gas pembawa berupa helium berkecepatan 1,8 mlmenit, dan rasio split 40:1. Oven diatur pada suhu 90 o C selama 0,5 menit, kemudian dinaikkan secara bertahap menjadi 110 o C dengan kecepatan 10 o Cmenit, meningkat ke 170 o C dengan kecepatan 5 o Cmenit dan akhirnya menjadi 210 o C dengan kecepatan 20 o Cmenit. Suhu injektor dan detektor adalah 275 o C. Campuran SCFA terdiri dari asetat, propionat dan butirat pada konsentrasi bervariasi dari 10 mM hingga 50 mM digunakan sebagai standar.

3.3.2. Tahap II: Aplikasi Supernatan pada Sel Kanker

3.3.2.1. Kultur sel

Sel VERO atau sel HCT-116 dipelihara di dalam mediaDulbescco’s Modified Eagle’s Media DMEM yang dilengkapi dengan 10 fetal bovine serumFBS , 100UmLpenisilin dan 100ugmLstreptomisin. Sel diinkubasi pada 37 o C, 5 CO 2 Untuk keperluan uji toksisitas, sel VERO atau sel HCT-116 sekitar 3 x 10 .Kompoisi DMEM dicantumkan dalam Lampiran 3. 4 Pada penelitian selanjutnya, sel HCT-116 1-2 x 10 sel ditumbuhkan di dalam 24 well plate. Setelah sel mencapai sekitar 50 konfluen, medium dibuang dan diganti oleh medium serupa dengan atau tanpa perlakuan supernatan. Untuk perlakuan, supernatan diencerkan dengan DMEM hingga dihasilkan beberapa konsentrasi asetat, propionat dan butirat. Konsentrasi asetat, propionat, butirat pada supernatan C. butyricum BCC B2571 adalah sebagai berikut: Perlakuan 1 3,4 mM; 3,0 mM; 2,7 mM, Perlakuan 2 6,8 mM; 6,0 mM; 5,3 mM, Perlakuan 3 13,6 mM; 12,0 mM; 10,6 mM. Pada supernatan E.recatale DSM 17629 konsentrasinya adalah: Perlakuan 1 3,7 mM; 4,2 mM; 3,6 mM, Perlakuan 2 7,3 mM; 8,4 mM; 7,2 mM, Perlakuan 3 14,7 mM; 16,7 mM; 14,3 mM. 6 dikulturkan di dalam tabung berukuran 75 mL. Setelah kepadatan sel mencapai sekitar 50, kultur diinkubasi lebih lanjut selama 48 jam dengan atau tanpa perlakuan supernatan. Per- lakuan yang diterapkan berupa Perlakuan 1 dan Perlakuan 2 supernatan C.buty- ricum BCC B2571 atau E.rectale DSM 17629 seperti disebutkan sebelumnya. Pada akhir masa inkubasi, sel dipanen dengan bantuan tripsin.

3.3.2.2. Penghitungan Jumlah sel

Sel diwarnai dengan tryphan blue 0,1. Jumlah sel hidup dan mati dihitung dengan hemositometer dibawah mikroskop inversi. Penghambatan proliferasi sel dihitung sebagai berikut: Penghambatan Proliferasi = A-BB x 100 Keterangan: A = jumlah sel hidup kontrol tanpa perlakuan supernatan B = jumlah sel hidup akibat perlakuan supernatan 3.3.2.3.Deteksi Apoptosis Sel HCT-116 10 4 dikulturkan di dalam 8-well slide chamberselama 24 jam. Media dibuang kemudian diganti dengan media serupa yang sudah dicampur dengan supernatan yang mengandung SCFA hasil fermentasi RS3. Kontrol berupa sel HCT- 116 yang dikulturkan dengan media yang tidak berisi supernatan hasil fermentasi. Inkubasi dilanjutkan lagi selama 48 jam. Sel kemudian difiksasi dengan 2 larutan glutaraldehidaselama 1 jam kemudian diwarnai dengan 10 mgL Hoechst 33258 selama 30 menit. Sel segera dicuci dengan phosphate buffer saline PBS. Sel diamati dibawah mikroskop fluoresen pada eksitasi 365 nm dan emisi 460 nm.Sel mati apoptosis ditandai oleh degradasi kromatin dan pendaran cahaya sangat jelas. Sel apoptosis diamati secara semi kuantitatif dengan cara menetapkan skor berikut: 0 0–1 pendaranlapang pandang, +1 2–4 pendaranlapang pandang, +2 5–6 pendaranlapang pandang dan +3 0 6 pendaran lapang pandang.

3.3.2.4. Real Time Polymerase Chain Reaction RT-PCRUntuk Analisis Ekspresi

Gen Bax dan Bcl-2 3.3.2.4.1. Ekstraksi total mRNA mRNA diisolasi dari sel HCT-116 dengan bantuan kit komersial RNeasy Kitt, Qiagen mengikuti prosedur yang ditetapkan oleh produsen. Konsentrasi mRNA kemudian diukur dengan spektrofotometer SmartSpec-Plus, Biorad pada260 nm. Prosedur lengkap ekstraksi mRNA dicantumkan dalam Lampiran 4.

3.3.2.4.2. Analisis RT-PCR

Ekspresi relatif mRNA Bax dan Bcl-2 terhadap house keeping geneGAPDH diukur pada mesin RT-PCR IQ5 Multicolor Real Time PCR Detection System, Biorad. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen dicantumkan dalam Tabel 7. Tabel7 Primer untuk amplifikasi gen pada analisis RT-PCR Gen Sekuen Bax Reverse primer : 5’-GCCTTGAGCACCAGTTTG-3’ Forward primer : 5’-CCCGAGAGGTCTTTTTCC-3’ Bcl-2 Reverse primer : 5’-CCTCTCCATCATCAACTT-3’ Forward primer : 5’-GCTCTAAAATCCATCCAG-3’ GAPDH Reverse primer : 5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGG-3’ Forward primer : 5’-CGGATTTGGTCGTATTGG-3’ Sumber: Nohara et al. 2007 Analisis RT-PCR dilaksanakan pada volume reaksi 25 μLdengan komposisi: 5 μl RNA template sekitar 400 ng RNA, 1 μLprimer masing-masing gen, 12,5 μLcampuran reaksi 2 x SYBR Green RT-PCR, 0,5 μLreverse transcriptasedan 5 μLair bebas nuclease. Reaksi berlangsung pada kondisi: 50 o C, 10 menit untuk akti- vasi reverse transcriptase, 95 o C, 5 menit untuk inaktivasi reverse transcriptase, ke- mudian reaksi diulang sebanyak 40 siklus pada 95 o C selama 10 detik denaturasi, 52 o C selama 10 detik annealing dan 72 o C selama 10 detik elongasi.Baselinedanthresholdditetapkan secara otomatis oleh piranti lunak yang terdapat di dalam mesin. Perpotongan kurva amplifikasi dengan nilai merupakan cycle threshold C t . Semuacontoh dinormalisasi terhadap ekpresi gen GAPDHGlutaraldehyde-3 Phosphate Dehydrogenase dan dinyatakan sebagai fold change. Ekspresi gen relatif dihitung dengan metoda ∆∆C t ΔC Pfaffl et al. 2002, sebagai berikut: t kontrol = C t target - C ΔC t referensi t perlakuan = C t target - C ΔΔC t referensi t = ΔC t kontrol - ΔC Ekspresi gen fold change = 2 t perlakuan Keterangan: ΔΔCt ΔC t kontrol = nilai C t ΔC dari sel kontrol tanpa perlakuan supernatan t perlakuan =nilai C t C dari sel dengan perlakuan supernatan t target =nilai C t gen target yaitu Bax atau Bcl-2; C t referensi = nilai C t GAPDH 3.3.2.5.Analisis Caspase-3 Caspase diukur dengan metoda ELISA dengan bantuan kit komersialHuman Caspase-3 Instant ELISA Bender MedSystem mengikuti instruksi yang ditetapkan oleh produsen. Sel dipanen kemudian dilisis dengan buferlisis. Caspase-3 yang terdapat di dalam lisat diukur jumlahnya.Caspase-3 di dalam lisat diikat oleh anti caspase-3 antibodi I yang menempel di dalam microwell. Antibodi poliklonal rabbit anti human-caspase-3 berikatan dengan human caspase-3 yang diikat oleh antibodi I, kemudian diikat oleh anti bodi pendeteksi Anti-rabbit-IgG-HRP. Anti bodi pendeteksi yang tidak terikat dihilangkan dengan cara dicuci. Substrat tetramethyl benzidine ditambahkan ke dalam “sumur” bereaksi dengan HRP membentuk warna yang diukur dengan cara spektrofotometri pada panjang gelombang 450 nm. Intensitas warna sebanding dengan jumlah caspase-3 dan diukur jumlahnya dengan standar human caspase-3 yang disediakan. Prosedur rinci dicantumkan dalam Lampiran 5.

3. 4. Analisis Data