Hasil di atas sejalan dengan studi yang dilaporkan oleh peneliti lain. Ruemmele et al. 1999 melaporkan bahwa butirat menghambat proliferasi sel
kanker kolon Caco-2. Efek penghambatan mulai terjadi pada konsentrasi 0,1 mM dan hambatan maksimal sekitar 30-50 terjadi pada konsentrasi 10mM.
Hatayama et al. 2007 melaporkan bahwa perlakuan butirat juga menghambat proliferasi sel LS174T, dimana besarnya hambatan tergantung pada
konsentrasinya. Sel yang diberi perlakuan butirat 1 atau 2 mM jumlahnya lebih kecil dibanding sel yang tidak diberi perlakuan butirat.
4.4.3. Apoptosis, Ekspresi mRNA Bcl-2 dan Bax
Apoptosis sel mati bunuh diri adalah suatu bentuk kematian sel. Apoptosis berperan penting dalam perkembangan organisme multi seluler.
Apoptosis juga penting untuk regulasi dan pemeliharaan populasi sel pada suatu jaringan dibawah kondisi fisiologi dan patologiMbazima et al. 2008.
Sel HCT-116 yang diberi paparan supernatan memiliki ciri-ciri sel apoptosis yang meliputi pengerutan sel, kondensasi bahkan fragmentasi khromatin.
Dibawah mikroskop fluoresen, sel tersebut tampak berpendar sedangkan sel HCT- 116 yang tidak diberi paparan SCFA tidak berpendar Gambar 10. Apoptosis
terjadi pada sel HCT-116 yang diberi paparan supernatan C.butyricum BCC B25671 maupun E.rectaleDSM 17629. Pengaruh supernatan terhadap apoptosis
pada sel HCT-116 yang diukur secara semikuantitatif dicantumkan dalam Tabel 14. Apoptosis terbesar terjadi pada sel HCT-116 yang diberi paparan supernatan
dari C.butyricum BCC B2571. Tidak tampak hubungan yang jelas antara besarnya skornilai apoptosis dengan konsentrasi SCFA butirat. Hal ini dapat dipahami
karena analisis tersebut bersifat semikuantitatif. Oleh karena itu, keberadaan sel apoptosis dikonfirmasi dengan pengamatan lain yang dijelaskan pada sub bab
selanjutnya.
Gambar10Pengaruh supernatan terhadap sel HCT-116 dengan pewarna
HOECHST 3258. C. butyricum BCC B2571 Perlakuan 1 asetat, propionat, butirat = 3,4 mM; 3,0 mM; 2,6 mM, Perlakuan 2
asetat, propionat, butirat = 6,8 mM; 6,0 mM; 5,2 mM. E. rectale DSM 17629. Perlakuan 1 asetat, propionat, butirat = 3,6 mM; 4,2
mM; 3,6 mM, Perlakuan 2 asetat, propionat, butirat = 7,2 mM; 8,4 mM; 7,2 mM. Perbesaran 40 X
Tabel 14 Pengaruh supernatan terhadap apoptosis pada sel HCT-116
Supernatan Skor
Kontrol Tanpa supernatan C.butyricumPerlakuan 1asetat, propionat, butirat = 3,4 mM; 3,0 mM; 2,6 mM
3 C. butyricumPerlakuan 2asetat, propionat, butirat = 6,8 mM; 6,0 mM; 5,3 mM
3 E.rectalePerlakuan 1asetat, propionat, butirat = 3,6 mM; 4,2 mM; 7,2 mM
2 E.rectalePerlakuan 2asetat, propionat,butirat = 7,2 mM; 8,4 mM; 7,2 mM
3
Kontrol
C. butyricum Perlakuan 1 C. butyricum Perlakuan 2
E. rectale Perlakuan 1 E. rectale Perlakuan 2
Hasil pengamatan ini sejalan dengan pernyataan yang disampaikan oleh peneliti lain. Avivi-Green et al. 2002 menyatakan bahwa butirat pada
konsentrasi 2-10 mM mampu menginduksi apoptosis pada sel Caco2 atau RSB. Gejala serupa juga ditemukan pada penelitian yang melibatkan hewan model. Le-
Leu et al. 2002melaporkan bahwa kadar SCFA dan butirat pada feses tikus berkorelasi positif dengan respon apoptosis akut pada distal colonic crypt.
Pemberian pakan yang berisi RS terbukti mampu meningkatkan kadar SCFA di sekum dan kolon tikus dan hal ini mengurangi terjadinya neoplasma intestinal dan
adenocarcinoma colorectalLe-Leu et al. 2007. Kim et al 2007 melaporkan bahwa apoptosis pada sel HCT-116 dapat diinduksi oleh komponen bioaktif
3,3’-diindolylmethane DIM. Apoptosis terjadi melalui dua jalur utama. Jalur pertama, apoptosis
diaktivasi oleh pengikatan TNF Tumor Necrosis Factor atauFatty acid synthetase ligand FasL pada reseptor permukaan. Jalur ini dikenal dengan jalur
ekstrinsikatau jalur kematian reseptor death receptor pathway. Kedua, stres intrinsik contoh kerusakan DNA atau keterbatasan growth factor memicu
sitokrom C keluar dari mitokondria. Jalur ini dikenal sebagai jalur intrinsik atau jalur mitokondria.Apoptosis melalui jalur mitokondria diatur oleh ekspresi gen
dari famili Bcl-2 B-cell lymphoma-2. Famili gen Bcl-2 terdiri dari dua kelompok yakni kelompok gen anti apoptosis dan pro-apoptosis. Famili Bcl-2
yang bersifat anti apotosis antara lain adalah Bcl-2, Bcl-
XL
maupun Bcl-W. Produk gen ini adalah protein yang berada di membran mitokondria dan berfungsi
untuk menstabilkan integritasnya. Stabilnya membran mitokondria menghalangi sitokhrom C lepas sehingga sel menjadi tidak berapoptosis. Famili gen Bcl-2
proapotosis menyandi protein yang berada di sitosol dan berfungsi sebagai sensor ketika sel menerima rangsangan misal kerusakan DNA. Protein ini mampu
membentuk homodimer atau heterodimer dan bermigrasi dari sitosol ke membran mitokondria dan berinteraksi dengan protein anti apoptosis. Interaksi tersebut
menghasilkan pori yang mengganggu stabilitas membran. Akibatnya sitokrom C menjadi lebih mudah lepas dan sel berapoptosis Elmore 2007.Famili gen Bcl-2
pro apoptosis diantaranya adalah Bad, Bax dan Bad.
Ekspresi gen Bcl-2 dan Bax B-lymphoma Cell associated X-protein pada sel HCT-116 tanpa atau diberi paparan supernatan disajikan pada Gambar 11.
mRNA Lampiran 12 digunakan sebagai templateuntuk sistesis cDNA yang kemudian diamplifikasi dan hasilnya dimonitor secara real-timedikenal dengan
RT-PCR. Hasil reaksi RT-PCR berupa plot amplifikasi yang contohnya disajikan pada Lampiran 13. Dari plot tersebut diketahui nilai C
t
Dari Gambar 11tampak bahwa supernatan C. butyricumBCC B2571 berisi butirat2,6 dan 5,3 mM meningkatkan p0.05 ekspresi Bax mRNA sebesar 7-9
kali dibanding ekspresinya pada sel HCT-116 yang tidak diberi paparan supernatan. Perlakuan tersebut relatif tidak mengubah ekspresi mRNA Bcl-2.
Respon berbeda terjadi ketika supernatan dari E.rectale 17629 dipaparkan pada sel HCT-116. Di sini, ekspresi mRNA Bcl-2 menurun secara nyata p0.05
akibat paparan supernatan sedangkan ekspresi mRNA Bax relatif tidak berubah. Ekspresi mRNA Bcl berkurang menjadi 0,2-0,3 kali dibandingkan ekspresi yang
terjadi pada sel yang tidak menerima paparan supernatan. Secara keseluruhan, data menunjukkan bahwa rasio bax terhadap Bcl-2 meningkat Gambar12. Hal
ini mengindikasikan bahwa protein pro-apoptosis berada dalam jumlah lebih besar dibanding protein anti apoptosis sehingga sel lebih mudah berapoptosis. Menurut
Ruemmele et al. 1999, rasio antara protein pro-apoptosis terhadap anti apoptosis merupakan regulator yang menentukan tingkat kemudahan sel untuk berapoptosis.
setiap gen target kemudian dihitung ekspresinya Lampiran 14. Ekspresi gen Bax atau Bcl-2 dipengaruhi
oleh perlakuan yang diterapkan Lampiran 15.
Gen Bcl-2 menyandi protein berukuran 26 kDa. Protein Bcl-2 berada di membran mitokondria dan dalam bentuk dimer sesama Bcl-2 bersifat
menstabilkan integritas membran mitokondria sehingga memberikan efek anti- apoptosis. Protein Bax berada di dalam sitosol dan mampu membentuk pori pada
membran mitokondria sehingga mempermudah keluarnya sitokrom C. Bila protein Bax membentuk dimer sesamanya atau dengan protein pro-apoptosis lain
seperti Bak maka sitokhrom dengan mudah keluar dari mitokondria. Kondisi serupa juga terjadi jika Bax membentuk dimer dengan protein Bcl-2. Dengan
demikian, tingkat kemudahan sel untuk berapoptosis ditentukan homodimer BaxBax dan heterodimer BaxBcl-2.
Gambar 11Pengaruh supernatan terhadap ekspresi mRNA Bax dan Bcl-2. A. Supernatan C. butyricum BCC B2571. Perlakuan 1 asetat, propionat,
butirat = 3,4 mM; 3,0 mM; 2,6 mM, Perlakuan 2 asetat, propionat, butirat = 6,8 mM; 6,0 mM; 5,2 mM. B Supernatan E. rectale DSM
17629. Perlakuan 1 asetat, propionat, butirat = 3,6 mM; 4,2 mM; 3,6 mM, Perlakuan 2 asetat, propionat, butirat = 7,2 mM; 8,4 mM; 7,2
mM.
A B
A
Gambar 12Pengaruh supernatan terhadap rasio ekspresi mRNA BaxBcl-2. Perubahan ekspresi gen pada sel kanker yang menerima perlakuan
supernatan berkaitan dengan kemampuan SCFA terutama butirat dalam menghambat aktifitas enzim HDAC Hinnebush et al. 2002, De Ruijter et al.
2003, Pajak et al. 2007. Pada sel kanker, butirat menghambat aktifitas HDAC sehingga protein histon mengalami hiperasetilasi sedemikian rupa sehingga
interaksi ionik antara protein histon dengan DNA terganggu. Akibatnya, kromatin atau eukromatin menjadi kurang kompak dan ekspresi sejumlah gen menjadi
berubah. Hinnebusch et al. 2002 melaporkan bahwa hiperasetilasi protein histon terjadi pada sel kanker kolon HT-29 atau HCT-116 yang diberi perlakuan butirat 5
mM. Butirat mengakibatkan up regulation ekspresi meningkat pada gen DR5, TNF-R1, TNF-R2, Fas-R, Smad3 dan p21WAF-1 danmengakibatkan down
regulation ekspresi berkurang pada cdk2, cdk4, cyclin A dan cyclin B1 Pajak et al. 2007. Pada penelitian ini, up regulation gen Bax terjadi pada sel kanker
HCT-116 dengan supernatan C. butyricum BCC B2571. Down regulation gen Bcl-2 terjadi pada sel kanker HCT-116 dengan perlakuan supernatan E. rectale
DSM 17629. 4.4.4.
Konsentrasi Caspase-3
Pengaruh supernatan terhadap konsentrasi Caspase-3 pada sel HCT-116 ditampilkan pada Lampiran 17. Konsentrasi Caspase-3 meningkat nyata p0.05
0,00 1,00
2,00 3,00
4,00 5,00
6,00 7,00
8,00 9,00
10,00
Kontrol Perlakuan 1
Perlakuan 2
R asi
o B
ax B
cl -2
Supernatan
C. Butyricum BCC B2571 E.rectale 17629
setelah sel HCT-116 diberi paparan supernatan berisi butirat 5 mM supenatan C.butyricum BCC B2571 atau E.rectaleDSM 17629,
Perlakuan 2. Konsentrasicaspase-3 yang dihasilkan oleh HCT-116 dengan supernatan dari
C.butyricum BCC B2571 lebih rendah dibanding sel yang diberi supernatan E.rectaleDSM 17629.
Gambar13Pengaruh supernatan terhadap konsentrasi caspase-3pada sel HCT-116.
A. Supernatan C. butyricum BCC B2571. Perlakuan 1 asetat, propionat, butirat = 3,4 mM; 3,0 mM; 2,6 mM, Perlakuan 2 asetat,
propionat, butirat = 6,8 mM; 6,0 mM; 5,2 mM. B Supernatan E. rectale DSM 17629. Perlakuan 1 asetat, propionat, butirat = 3,6 mM;
4,2 mM; 3,6 mM, Perlakuan 2 asetat, propionat, butirat = 7,2 mM; 8,4 mM; 7,2 mM.
B A
Ada komponen lain yang diduga memberikan kontribusi terhadap perbedaan jumlah Caspase-3 yang dihasilkan oleh HCT-116. Gambar 13 menampilkan
konsentrasi Caspase-3 yang dihasilkan oleh sel HCT-116 tanpa atau dengan perlakuan supernatan.Jan et al. 2002, melaporkan bahwa propionat murni
maupun yang dihasilkan oleh propionibacterium menginduksi procaspase-3 dan memotongnya dalam bentuk aktif sebagai caspase-3. Propionat hasil fermentasi
RS3 tampaknya juga berperan dalam produksi Caspase-3 Ada beberapa jenis caspase diantaranya adalah caspase-3 yang menjadi
eksekutor utama dalam proses apoptosis. Caspase-3 ada di dalam sel dan dihasilkan dalam bentuk inaktif atau zimogen. Zimogen tersebut menjadi aktif
bila sel mengalami apoptosis. Caspasejuga berperan penting dalam mengaktikan DNAsedan memotong protein struktural di inti sel Elmore 2007.Apoptosis pada
sel kanker yang diinduksi oleh SCFA maupun komponen bioaktif ditandai oleh aktifnya caspase-3 Avivi-Green et al. 2002, Kim et al. 2005, Hsu et al. 2009.
Caspase Cystein-Aspartate Protease merupakan salah satu enzim protease spesifik dengan sisi aktif sistein dan memotong substrat pada situs aspartat.
Ruemmele et al. 1999 melaporkan bahwa caspase-3 memotong protein PARP atau poly-ADP-ribose polymerase pada sel Caco-2 yang mengalami apoptosis
oleh adanya induksi butirat. PARP merupakan proteinenzim yang terlibat dalam reparasi DNA. Jika PARP dipotong oleh caspase-3 maka enzim menjadi aktif
dankerusakan DNA dapat diperbaiki. Dengan kata lain, sel kanker menjadi tidak berkembang. Substratlain bagi caspase-3 adalahCAD caspase activated DNAse.
Dalam keadaan normal, CAD bersifat inaktif dan membentuk komplek dengan ICAD inhibitor of CAD. Jika sel berapoptosis, maka ICAD dipotong oleh
caspase-3 dan hal ini mengakibatkan CAD aktif dan konsekuensinya DNA menjadi terfragmentasi Elmore 2007. Substrat yang menjadi sasaran bagi
caspase-3 pada penelitian ini masih perlu dieksplorasi
4.4.5. Perkiraan Model Apoptosis
