Bahan Penelitian Alat Penelitian Tata Cara Penelitian

2. Definisi Umum a. Jamu pahitan Brotowali adalah jamu yang biasa dikonsumsi masyarakat untuk mengobati gatal-gatal, menambah nafsu makan, dan mengatasi kencing manis. Bahan dasar pembuatan jamu adalah batang brotowali baik yang masih segar ataupun yang telah dikeringkan. Sampel jamu pahitan brotowali berbentuk cair, berwarna coklat tua, mempunyai rasa yang pahit dan dikemas dalam botol kaca bening. Sampel jamu pahitan brotowali diambil dari penjual jamu gendong di Kelurahan Tonggalan, Klaten Tengah. b. Uji Angka KapangKhamir merupakan suatu uji cemaran mikroba yang dilakukan dengan menghitung jumlah kapang dan atau khamir yang terdapat dalam jamu pahitan brotowali. Media yang digunakan adalah Potato Dextrose Agar PDA menggunakan Metode Analisis Mikrobiologi Tahun 2006 MA PPOMN nomor 96mik00. c. Uji identifikasi Salmonella spp. merupakan serangkaian uji untuk mengidentifikasi Salmonella spp. yang terdapat dalam jamu pahitan brotowali dengan melihat ada tidaknya Salmonella spp. pada media selektif, media identifikasi, dan tahap identifikasi menggunakan uji biokimia dengan Metode Analisis Mikrobiologi Tahun 2006 MA PPOMN nomor 94mik00.

C. Bahan Penelitian

1. Cairan jamu pahitan brotowali yang diperoleh dari pedangang jamu gendong di Kelurahan Tonggalan, Klaten Tengah. 2. Media yang digunakan untuk AKK yaitu PDA oxoid. Media pengkayaan yaitu Rapaport Vassiliadis Oxoid, media isolasi yaitu Salmonella Shigella Agar Oxoid, media identifikasi: media glukosa, media laktosa, media manitol, media maltosa, media sakarosa, media SIM Oxoid, media Simmons citrate Agar Oxoid, Nutrient Agar Oxoid. 3. Kloramfenikol Bratako Chemika, PDF Oxoid, Aquadest steril, etanol 70 dan Kovacs Merck. 4. Bakteri baku sebagai standar pembanding adalah Salmonella typhi ATCC 14028.

D. Alat Penelitian

Autoklaf model: KT-40 No. 108049 Midorigaoka Japan, incubator WTC binder, oven, Bunsen, pipet tetes, mikropipet Iwaki, tabung reaksi Pyrex, cawan petri, pipet volume, Beaker glass Pyrex, gelas ukur Pyrex, Erlenmeyer Pyrex, Jarum ose, stomacher Seward, plastik steril.

E. Tata Cara Penelitian

1. Pemilihan dan pengumpulan sampel jamu brotowali Penentuan dan pemilihan tempat pengambilan sampel merupakan langkah awal yang diperlukan dalam pengujian mikrobiologis untuk menjamin kualitas dan keamanan jamu. Pengambilan sampel dilakukan menggunakan metode Non-Random dengan teknik purposive sampling. Menurut Notoatmodjo 2010 menyatakan bahwa pengambilan sampel non-random adalah pengambilan sampel yang tidak didasarkan atas kemungkinan yang dapat diperhitungkan, tetapi semata-mata hanya berdasrkan kepada segi kepraktisan. Sedangkan purposive sampling didasarkan pada suatu pertimbangan tertentu yang dibuat oleh peneliti sendiri, berdasarkan ciri atau sifat populasi yang sudah ada. Sampel diambil dengan metode ini karena pengambilan sampel berdasarkan pertimbangan yang dibuat oleh peneliti sendiri yaitu berdasarkan jamu yang paling banyak diminati oleh masyarakat. Sampel jamu pahitan brotowali diperoleh dari penjual jamu di Kelurahan Tonggalan, Klaten Tengah. Wilayah tersebut dipilih oleh peneliti karena belum banyak penelitian yang dilakukan di daerah tersebut. Selain itu, di Kelurahan Tonggalan, Klaten Tengah masih sering dijumpai masyarakat yang mengonsumsi jamu gendong. Berdasarkan survey, terdapat 5 penjual jamu gendong di Kelurahan Tonggalan, Klaten Tengah, namun peneliti hanya memilih 3 penjual jamu yang paling diminati masyarakat dan memiliki konsumen tetap. Penjual jamu yang dipilih untuk dijadikan sampel telah berjualan jamu lebih dari 7 tahun dan jamu yang dijajakan selalu terjual habis setiap harinya. Pengambilan sampel jamu pahitan brotowali dari penjual jamu dilakukan 1 kali pengambilan pada tanggal 19 Oktober 2015 pukul 06.00 WIB. Hal ini dilakukan untuk membandingkan bagaimana kualitas antara 3 penjual jamu dengan melihat Angka KapangKhamir AKK, dan identifikasi Bakteri Salmonella spp. Jamu pahitan brotowali diambil dari 3 penjual jamu gendong yang berbeda dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali untuk setiap sampel dengan tujuan memperkecil kesalahan hasil penelitian sehingga penelitian lebih valid. Pada saat pengambilan sampel, jamu pahitan brotowali dimasukkan ke dalam botol steril secara aseptis dan ditutup rapat dengan tujuan agar tidak ada kontaminasi berupa bakteri ataupun pengotor lain dari wadah saat pengambilan sampel yang dapat mengganggu hasil penelitian. Kemudian, dibawa ke laboratorim menggunakan cool box untuk menghambat pertumbuhan berbagai kontaminan bakteri atau jamur yang mungkin tumbuh selama perjalanan. Gambar 1. Sampel jamu pahitan brotowali dalam wadah botol steril 2. Persiapan sampel Bagian wadah jamu pahitan brotowali akan dibuka secara aseptis didekat nyala api Bunsen yang sebelumnya dibersihan menggunakan alkohol 70. 3. Homogenisasi dan pengenceran sampel Homogenisasi merupakan tahap awal yang harus dilakukan sampel agar diperoleh distribusi mikroba yang merata di dalam sampel sehingga mudah untuk diamati Radji, 2010. Homogenisasi sampel bertujuan untuk membebaskan sel-sel bakteri atau jamur yang masih yang terlindungi oleh partikel dari sampel yang akan diperiksa serta digunakan untuk mengaktifkan kembali sel-sel bakteri atau jamur yang kemungkinan pertumbuhannya terganggu karena berbagai kondisi yang kurang sesuai di dalam sampel. Proses homogenisasi dilakukan secara aseptis dekat nyala api Bunsen dengan mengencerkan 25 ml sampel dalam 225ml larutan pengencer Pepton Dilution Fluid PDF dan dihomogenkan menggunakan stomacher dengan kecepatan 300 rpm sehingga diperoleh pengenceran 10 -1 . Larutan pengencer Pepton Dilution Fluid PDF digunakan sebagai sumber nutrisi untuk pertumbuhan mikroba karena mengandung banyak pepton. Pepton merupakan salah satu sumber nitrogen yang dapat digunakan oleh mikroba untuk dapat hidup dan tumbuh dalam media Bridson, 2006. Pengenceran juga dilakukan dengan tujuan untuk membantu dalam perhitungan koloni yang benar Lay, 1994. Pengenceran dilakukan di dekat nyala api Bunsen untuk menjaga ke aseptifan sampel. Pengenceran dilakukan dengan cara mengambil 1 ml dan diencerkan dengan 9 ml larutan pengencer PDF sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10 -2 . Cara yang sama dilakukan untuk membuat pengenceran hingga 10 4 . Pengenceran suspensi sampel dimaksudkan untuk mendapat koloni yang terpisah dan jumlah koloni yang sekurang-kurangnya dalam satu cawan memenuhi range yang telah ditetapkan sehingga mempermudah perhitungan. Apabila pengenceran tidak dilakukan pengenceran, maka jumlah koloni yang tumbuh terlalu padat dan pekat sehingga akan mempersulit perhitungan koloni yang tumbuh. 4. Pengujian Angka Kapangkhamir a. Pembuatan larutan Kloramfenikol 1 Sebanyak 1 gram kloramfenikol dilarutkan dalam 100 ml aquadest steril b. Pembuatan media Potato Dextrose Agar PDA Tiga puluh sembilan gram serbuk PDA disuspensikan dalam 900 ml aquadest, kemudian dilarutkan dengan hot plate dan diaduk menggunakan magnetic stirrer hingga merata. Kloramfenikol 100 gramL ditambahkan dalam media dan dicampur hingga merata. Sterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 o C. c. Uji Angka KapangKhamir Uji KapangKhamir merupakan salah satu parameter penjaminan mutu sebuah obat tradisional yang dilakukan dengan menghitung berapa banyak koloni kapangkhamir yang tumbuh dalam media. Prinsip uji AKK yaitu Uji AKK Angka Kapang Khamir mempunyai prinsip yaitu pertumbuhan kapang dan khamir setelah cuplikan diinokulasikan pada media yang sesuai dan diinkubasi pada suhu 20 o C-25 o C selama 5 hari. Dilakukan inkubasi pada suhu 25 o C karena kapangkhamir bersifat mesofilik atau dapat tumbuh pada suhu ruangan 20 o C-25 o C, inkubasi dengan posisi terbalik supaya uap air yang terbentuk selama masa inkubasi tidak menetes pada media dan mempengaruhi pertumbuhan mikroba, dan inkubasi selama 5 hari dilakukan karena koloni jamur tumbuh lebih lambat dan memiliki struktur lebih kompleks dibandingkan dengan bakteri, sehingga diperlukan waktu beberapa hari sampai tumbuh koloni yang dapat dilihat pada permukaan agar Cappuucino, 2008. PDA Potato Dextrose Agar merupakan media utama untuk menumbuhkan jamur dan dikombinasikan dengan antibiotik untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Media ini mengandung ekstrak kentang, glukosa dan agar yang digunakan sebagai nutrisi bagi pertumbuhan jamur. Media PDA ini cocok untuk menumbuhkan dan menghitung kapang khamir pada produk makanan ataupun minuman karena menurut Radji 2010, kapang dan khamir dapat tumbuh optimal pada rentang pH 5-6, sedangkan media PDA ini memiliki pH 5,6 + 0,2. Selain itu, digunakan juga antibiotik untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Dalam penelitian ini antibiotik yang digunakan adalah kloramfenikol sebanyak 100 gL untuk mendapatkan hasil pertumbuhan berupa kapangkhamir tanpa pertumbuhan bakteri. Kloramfenikol digunakan karena mempunyai bekerja pada spektrum luas, efektif baik terhadap gram positif maupun gram negatif. Mekanisme kerja kloramfenikol melalui penghambatan terhadap biosintesis protein pada siklus pemanjangan rantai asam amino, yaitu dengan menghambat pembentukan ikatan peptida. Antibiotika ini mampu mengikat subunit ribosom 50-S sel mikroba target secara terpulihkan, akibatnya terjadi hambatan pembentukan ikatan peptida dan biosintesis protein. Kloramfenikol umumnya bersifat bakteriostatik, namun pada konsentrasi tinggi dapat bersifat bakterisid terhadap bakteri-bakteri tertentu Ikatan peptida berperan untuk pembentukan dinding sel bakteri. Apabila ikatan peptida tidak terbentuk, maka pembentukan dinding sel akan terganggu dan sel akan lisis. Kloramfenikol tidak akan menghambat pertumbuhan kapangkhamir karena kapangkhamir adalah sel eukariotik Susanti, 2009. Uji AKK ini menggunakan metode pour plate agar sampel yang ditanam dapat tersebar merata pada cawan petri, sehingga mempermudah pengamatan dan perhitungan koloni yang tumbuh. Pada penelitian ini, digunakan kontrol yang berisi media PDA dan pengencer PDF agar dapat melihat ada atau tidaknya kapangkhamir yang berasal dari pelarut. Suspensi PDF dan jamu masing-masing pengenceran dipipet sebanyak 1ml dengan cara aseptis ke dalam cawan petri steril dan dibuat duplo. Media PDA yang telah dibuat sebanyak 15 ml dituang ke dalam cawan petri dan digoyangkan sehingga campuran tersebut merata. Cawan petri dibalik setelah agar membeku dan diinkubasi pada suhu 25 o C atau pada suhu kamar selama 5 hari. Pengamatan dilakukan setiap hari sampai hari ke 5. Koloni kapang dan khamir dihitung setelah 5 hari. Uji sterilitas media dilakukan dengan menuangkan media PDA dalam cawan petri dan dibiarkan memadat. Uji sterilitas pengencer dilakukan dengan cara menuangkan media PDA yang ditambahkan sebanyak 1 ml Peptone Dilution Fluid PDF lalu dibiarkan memadat PPOMN, 2006. 5. Uji Salmonella spp. dalam jamu pahitan brotowali a. Uji Pengkayaan pada media Rapaport Vassiliadis Sebanyak 9 tabung reaksi disiapkan, masing –masing tabung diisi dengan 9 ml Rapaport. Secara asepetis, dipipet 1 ml suspensi jamu pahitan brotowali, kemudian diisolasikan pada 9 ml Rapaport, diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Media Rapaport akan menjadi keruh jika terdapat Salmonella spp. Pada kontrol positif dilakukan dengan uji yang sama berupa kultur murni Salmonella thypi ATCC 14028. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari biru jernih menjadi keruh. Hasil dari pengujian dibandingkan dengan hasil pertumbuhannya berdasarkan kekeruhan. b. Isolasi Salmonella spp. pada media selektif Pada permukaan Salmonella Shigella Agar diisolasikan 1 sengkelit dari biakan pengkayaan dengan cara streak Plate Method 4 kuadran, diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Prosedur yang sama dilakukan terhadap kontrol positif, yaitu kultur murni Salmonella thypi ATCC 14028. Hasil dari pengujian dibandingkan dengan hasil pertumbuhannya berdasarkan morfologi koloni yang tumbuh. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya koloni berwarna merah kekuningan dengan titik hitam. c. Uji Konfirmasi Uji Biokimia Salmonella spp. dalam jamu pahitan brotowali Koloni spesifik yang tumbuh pada media Salmonella Shigella Agar dipilih satu dan diinokulasikan pada Nutrient Agar NA secara goresan, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Dari biakan NA miring dilakukan uji fermentasi gula-gula, uji sulfur, uji indol, uji motilitas, uji sitrat, uji Voges-Proskauer, uji Methyl Red, dan uji katalase. Prosedur yang sama dilakukan terhadap kontrol positif, yaitu kultur murni Salmonella typhi ATCC 14028. Hasil dari pengujian dibandingkan dengan hasil pertumbuhannya berdasarkan perubahan warna yang terjadi. 1 Uji Fermentasi gula-gula a Uji Fermentasi Glukosa Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media glukosa dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi kuning. b Uji Fermentasi Laktosa Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media laktosa dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi kuning. c Uji Fermentasi Manitol Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media manitol dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi kuning. d Uji Fermentasi Maltosa Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media maltosa dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi kuning. e Uji Fermentasi Sakarosa Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media sukrosa dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi kuning. 2 Uji Sulfur Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media Sulphur Indol Motility dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya warna hitam di sepanjang bekas inokulasi. 3 Uji Indol Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media Sulphur Indol Motility secara tusukan dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. 1 ml pereaksi indol kovacs ditambahkan ke dalam biakan, kemudian digojog dan diamkan beberapa menit. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna merah cherry pada permukaan biakan. 4 Uji Motilitas aseptis pada media Sulphur Indol Motility secara tusukan pada agar tegak dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan mikroba tidak hanya pada bekas tusukan yang menunjukkan bakteri tersebut bersifat motil. 5 Uji Sitrat Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media Simmon Sitrat Agar dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan perubahan warna media dari hijau menjadi biru. 6 Uji Voges-Proskauer Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media MR-VP dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Setelah diinkubasi tambah kan 0.6 ml larutan α-naphthol dan 0.2 ml KOH 40, kemudian digoyang-goyang sampai tercampur dan didiamkan selama 4 jam. Hasil uji positif apabila terjadi perubahan warna pink sampai merah delima. Salmonella spp. memberikan hasil negatif untuk uji VP yaitu tidak terjadi perubahan warna pada media. 7 Uji Methyl Red Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media MR-VP dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Setelah diinkubasi tambahkan 5 tetes larutan metil merah dan tabung digoyang-goyang sampai tercampur. Hasil uji positif ditandai dengan adanya difusi warna merah ke dalam media. Hasil negatif ditandai dengan terjadinya warna kuning pada media. Salmonell memberikan hasil positif untuk uji Methyl Red. 8 Uji Katalase Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada gelas objek kemudian ditetesi dengan H 2 O 2 . Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya buih.

F. Analisis Hasil