4.5.3.2.3 Pembiakan Spesimen Porphyromonas gingivalis yang digunakan adalah spesimen stem sel
Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 yang dibiakkan secara murni pada media MHA dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur Gambar 16. Ambil sebanyak
1-2 ose dari biakan murni bakteri lalu disuspensikan dalam larutan 0,9 NaCl hingga diperoleh kekeruhan sesuai 0,5 Mc Farland Standard atau setara dengan jumlah
1 x 10
8
CFUml CFU: Colony Forming Unit.
4.5.3.2.4 Penentuan KHM Bahan Coba
Konsentrasi ektrak etanol daun Afrika yang diuji dalam penelitian ini adalah dimulai dari 100, 50, 25, 12,5, 6,25, dan 3,125. Dari masing-masing
konsentrasi tersebut diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet ke dalam masing-
masing tabung bahan coba tersebut kemudian divorteks, lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam pada inkubator CO
2
. Tabung dalam pengujian nilai KHM direplikasi sebanyak 4 kali. Amati kekeruhan, lalu bandingkan tabung-tabung tersebut
dengan kontrol Mc Farland untuk menentukan nilai KHM, yaitu konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan Porphyromonas gingivalis
dalam media pembenihan setelah diinkubasi 24 jam. Gambar 16. Porphyromonas gingivalis ATCC
33277 yang telah dibiakkan secara murni pada media MHA dalam
suasana anaerob
4.5.3.2.5 Penentuan KBM Bahan Coba
Hasil pengujian penentuan nilai KHM dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan menggunakan metode Drop Plate Miles Misra. Dengan metode
ini dapat dihitung jumlah bakteri hidup yang telah disuspensikan dalam bahan coba. Setelah diinkubasi pada prosedur penentuan KHM, bahan coba dari konsentrasi
seperti di atas divorteks dan diambil 50 µl untuk setiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat yaitu Muller Hinton Agar. Petri direplikasikan sebanyak 4 kali
replikasi, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering kemudian diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37
o
C selama 24 jam. Kemudian, dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan nilai KBM dengan bantuan kaca pembesar.
Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri. Apabila bentuk koloni
melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Koloni Porphyromonas gingivalis pada media padat
berbentuk bulat dan berwarna putih keruh. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, dibuat
rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri
merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat
sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.
Contoh cara perhitungan koloni pada metode Drop Plate Miles Misra adalah a. Pada media padat ditetesi sebanyak 50 µl suspensi bahan coba dengan
mikropipet b. Kemudian dihitung jumlah koloni yang ada dengan menggunakan
mikroskop dan didapatkanlah sebanyak 5 koloni. c. Jadi jumlah bakteri pada bahan coba tersebut adalah 5 x 1 faktor
pengenceran x 20 faktor pengali = 100 CFUml
4.5.3.2.6 Penghitungan Koloni Bakteri dengan Serial Dilusi
