Pengujian pengaruh
prebiotik terhadap
pertumbuhan probiotik
menggunakan E. faecium IS-27526 berusia 8 jam untuk menjamin kecukupan jumlah dan kesiapan pertumbuhan. Kurva hitungan cawan menunjukkan awal
fase log mulai jam ke-4, tidak sesuai dengan kurva absorbansi yang menjadi dasar penentuan kurva pertumbuhan. Namun hal ini tidak mempengaruhi
kondisi kultur yang diambil, yaitu pada usia 8 jam, karena masih berada dalam fase log atau eksponensial dengan kondisi pembelahan biner yang sama.
B. Pengaruh Prebiotik terhadap Pertumbuhan E. faecium IS-27526
Manfaat minimum prebiotik adalah mempengaruhi fisiologi dan modulasi mikrobiota pada bagian tertentu, seperti saluran pencernaan Marlis,
2008. Pengujian langsung terhadap probiotik dirasa penting untuk melihat efek prebiotik terhadap sifat fisiologi, khususnya pertumbuhan, probiotik
secara spesifik. Penelitian terhadap prebiotik yang tepat untuk probiotik lokal seperti E. faecium IS-27526 dan L. plantarum IS-10506 belum pernah
dilakukan. Prebiotik yang sudah umum dikenal dan populer digunakan adalah inulin
dan fruktooligosakarida FOS. Prebiotik inulin dan FOS telah banyak diteliti efeknya hingga secara in vivo dan banyak digunakan secara komersial di
produk pangan Rouzaud, 2007. Pengaruh prebiotik terhadap pertumbuhan E. faecium IS-27526 diamati
dengan pengukuran absorbansi, pH, Total Asam tertitrasi TAT yang dikonversi menjadi persen asam laktat, dan jumlah sel hidup dengan metode
hitungan cawan. Probiotik E. faecium IS-27526 ditumbuhkan dalam media m- MRSB yang disuplementasi prebiotik inulin atau FOS kemudian dibandingkan
dengan m-MRSB + Glukosa sebagai standar dan m-MRSB sebagai kontrol.
Gambar 7 Pengaruh jenis prebiotik terhadap pertumbuhan absorbansi E. faecium IS-27526
Gambar 7
menunjukkan hasil
pengukuran absorbansi
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm yang menggambarkan
pengaruh prebiotik inulin dan FOS terhadap pertumbuhan probiotik E. faecium IS-27526. Nilai absorbansi tertinggi menunjukkan pertumbuhan
tertinggi E. faecium IS-27526, yaitu pada media m-MRSB + Glukosa dengan nilai absorbansi 1.285 pada waktu inkubasi 12 jam. Glukosa adalah sumber
karbon paling umum dalam lingkungan. Glukosa merupakan sumber energi yang segera dapat digunakan karena glukosa dapat dengan mudah dan lebih
cepat masuk ke dalam sel Piliang dan Djojosoebagio, 2006. E. faecium IS-27526, yang tergolong dalam Bakteri Asam Laktat BAL,
tumbuh baik di media yang diperkaya glukosa tinggi karena glukosa merupakan sumber karbon utama dan juga merupakan sumber pembentukan
asam laktat. White 1995 menyatakan bahwa umumnya hampir semua bakteri memiliki enzim metabolisme glukosa yang hadir di setiap kondisi dan siap
tumbuh dalam media mengandung glukosa di setiap waktu. Glukosa merupakan substansi kaya energi yang penting karena umumnya dalam daur
hidup mikroorganisme diawali dengan konversi senyawa menuju jalur katabolisme glukosa Bertolani, 2007.
Pertumbuhan E. faecium IS-27526 dalam m-MRSB tanpa suplementasi sumber karbon tergolong rendah. Pot et al. 1994 menyatakan bahwa BAL
membutuhkan sumber
karbohidrat yang
dapat difermentasi
untuk pertumbuhannya. Waktu inkubasi yang sama, yaitu 12 jam, menunjukkan
absennya sumber karbon membuat pertumbuhan E. faecium IS-27526 tidak sebaik dalam m-MRSB + Glukosa. Nilai absorbansi E. faecium IS-27526 pada
media m-MRSB hanya sebesar 0.349. Pertumbuhan dalam m-MRSB hanya mengandalkan sumber nitrogen dan vitamin yang berasal dari pepton, yeast
extract, dan lab lemco powder yang merupakan ekstrak daging. Nilai absorbansi E. faecium IS-27526 pada jam ke-12 dalam media m-
MRSB + Inulin dan m-MRSB + FOS masing-masing sebesar 0.407 dan 0.389. Kurva absorbansi menunjukkan adanya tren pertumbuhan namun setelah itu
bersifat statis. Hal ini sesuai dengan kurva hasil hitungan cawan Gambar 8 yang menunjukkan adanya fase log yang dilanjutkan dengan fase stasioner.
Gambar 8 Pengaruh jenis prebiotik terhadap pertumbuhan log cfuml E. faecium IS-27526
Jumlah E. faecium IS-27256 pada jam ke-0 berkisar pada 7 log cfuml. Hasil pengukuran absorbansi berkorelasi dengan hitungan cawan dalam satuan
log cfuml. Pertumbuhan tertinggi diperoleh pada absorbansi tertinggi, yaitu 1.285 pada jam ke-12, dan jumlah sel tertinggi sebesar 9.3 log cfuml pada
jam yang sama dalam media m-MRSB + Glukosa. Media dengan sumber karbon glukosa mendukung pertumbuhan sel sehingga jumlah sel hidup tinggi
pada metode hitungan cawan. Banyaknya sel meningkatkan nilai penyerapan cahaya atau absorbansi pada metode turbidimetri.
Pertumbuhan tertinggi E. faecium IS-27256 pada media m-MRSB ditunjukkan pada jam ke-12 sebesar 9.0 log cfuml absorbansi 0.349.
Pertumbuhan tertinggi E. faecium IS-27256 pada media m-MRSB + Inulin di
jam ke-12 sebesar 9.1 log cfuml absorbansi 0.407. Analisis statistik menunjukkan bahwa pertumbuhan E. faecium IS-27526 pada jam ke-12 dalam
kedua media tersebut tidak berbeda nyata pada taraf signifikansi 5 Lampiran 17.
Kurva pertumbuhan E. faecium IS-27526 juga menunjukkan bahwa pola pertumbuhan pada media m-MRSB + Inulin menyerupai kurva pertumbuhan
pada media m-MRSB Gambar 8. Hal ini menunjukkan bahwa kemungkinan pertumbuhan E. faecium IS-27526 memanfaatkan nutrisi dalam media m-
MRSB dan tidak dengan memanfaatkan inulin. E. faecium IS-27526 pada media m-MRSB masih dapat mengalami
pertumbuhan, namun tidak secepat pertumbuhan pada media m-MRSB + Glukosa. Media m-MRSB merupakan media MRSB modifikasi yang terdiri
dari mineral, vitamin, dan protein tanpa sumber karbon. Lingkungan yang kekurangan sumber karbon membuat E. faecium IS-27526 memanfaatkan
sumber lain untuk menunjang pertumbuhannya. Surono 2004 menyatakan BAL membutuhkan nutrisi kompleks untuk
pertumbuhannya, yaitu asam amino dan vitamin. E. faecium IS-27526, yang tergolong sebagai BAL, dapat tumbuh mengandalkan asam amino sebagai
sumber energi dalam kondisi lingkungan yang kritis sumber karbon. Kedua nutrisi ini dapat diperoleh dari kandungan m-MRSB yaitu yeast extract, lab
lemco powder yang merupakan ekstrak daging, serta pepton. Clifton 1958 menyatakan pepton dapat
berperan sebagai sumber penyedia karbon dan nitrogen, serta meyuplai elemen anorganik untuk pertumbuhan bakteri.
Penelitian serupa telah dilakukan oleh Audisio et al. 2007 yang menumbuhkan E. faecium CRL 1385 pada media tanpa glukosa, dengan
glukosa, dengan gula merah, serta dengan penambahan gula putih. Media basis yang digunakan adalah LAPT yang mengandung meat peptone, yeast
extract, dan Tween 80. Hasil penelitian menunjukkan adanya pertumbuhan E. faecium CRL1385 pada media tanpa glukosa, yaitu sekitar 8.5 – 9.0 log
cfuml. Pada taraf signifikansi 5, pertumbuhan E. faecium CRL 1386 tidak berbeda nyata pada tiap media dilihat dari nilai laju pertumbuhannya.
Jumlah sel hidup E. faecium IS-27526 dalam media m-MRSB + FOS sebesar 8.7 log cfuml pada jam ke-4, kemudian menunjukkan pertumbuhan
tertinggi 8.8 log cfuml pada waktu inkubasi 8 jam. Akan tetapi, terjadi penurunan menjadi 8.5 log cfuml ketika waktu inkubasi 12 jam dan 8,2 log
cfuml pada waktu inkubasi 24 jam, namun penurunan jumlah tidak mencapai hingga 1 log cfuml.
Perubahan jumlah sel hidup E. faecium IS-27526 dari jam ke-4 hingga jam ke-24 dalam m-MRSB + FOS tidak berbeda signifikan dari analisis
statistik. Namun, jumlah sel hidup pada jam ke-8 berbeda nyata dengan jumlah sel pada jam ke-24. Peningkatan jumlah sel hidup pada media m-
MRSB + FOS mengindikasikan bahwa E. faecium IS-27526 dapat
memanfaatkan FOS untuk pertumbuhannya, tetapi kemudian menurun. Jumlah sel hidup atau kurva pertumbuhan dapat ditingkatkan dengan
penambahan konsentrasi FOS. Konsentrasi FOS dalam media pengujian ini adalah 1 bv. Nutrisi yang paling penting dalam pertumbuhan sel adalah
sumber karbon dan dalam hal ini dapat diperoleh dari prebiotik seperti FOS. Sehingga dimungkinkan bahwa jumlah sel hidup dapat ditingkatkan bila
konsentrasi prebiotik ditingkatkan lebih banyak, yaitu melebihi 1 bv. Fardiaz 1989b menyatakan bahwa pada fase log pertambahan jumlah
sel sensitif terhadap lingkungan dan dapat diperlambat oleh kurangnya zat nutrisi pada media hingga sel akan memasuki fase stasioner. Dinyatakan juga
bahwa nutrisi penting untuk membentuk energi dan menyusun komponen sel. Penambahan jumlah nutrisi dapat meningkatkan jumlah sel yang ada karena
terjadi sintesis RNA, DNA, dan protein baru secara cepat sehingga dapat meningkatkan kecepatan pembelahan sel Mandelstam dan McQuillen, 1989.
Pengukuran pH Gambar 9 di jam ke-12 jam pada media m-MRSB + Glukosa, yaitu sebesar 4.7, merupakan nilai pH terendah dibanding ketiga
jenis media lainnya. Hal ini menunjukkan paling tingginya pertumbuhan E. faecium IS-27526 pada media m-MRSB + Glukosa, sesuai dengan pengukuran
absorbansi dan hitungan cawan Gambar 7 dan Gambar 8. Nilai pH mengalami penurunan hingga 4.5 di jam ke-24, namun penurunan ini tidak
berbeda nyata berdasarkan analisis statistik Lampiran 18.
Gambar 9 menunjukkan nilai pH media m-MRSB serta m-MRSB + Inulin memiliki nilai pH yang saling berdekatan. Nilai pH media m-MRSB
serta m-MRSB + Inulin tidak berbeda nyata dari jam ke-0 hingga jam ke-24 dari hasil analisis statistik. E. faecium IS-27526 tidak membentuk asam laktat
selama pertumbuhannya dalam kedua media ini, sehingga pH tidak mengalami perubahan nyata. Inulin tidak dapat difermentasi E. faecium IS-27526
menghasilkan asam laktat yang akan menurunkan pH media.
Gambar 9 Pengaruh jenis prebiotik terhadap nilai pH media selama pertumbuhan E. faecium IS-27526
E. faecium IS-27526 merupakan probiotik yang tergolong dalam BAL homofermentatif yang melakukan fermentasi asam laktat yang mengubah
karbohidrat hampir seluruhnya menjadi produk tunggal, yaitu asam laktat Madigan et al., 1997 dalam Surono, 2004b. BAL homofermentatif dapat
mengubah 95 glukosa atau heksosa lainnya menjadi asam laktat dan sejumlah kecil CO
2
Rahman et al., 1992. Sumber karbohidrat yang dapat difermentasi meliputi glukosa, fruktosa,
galaktosa, sukrosa, maltosa, latosa, dekstrin, sorbitol, dan manitol Gilliland, 1986. Surono 2004b menyatakan BAL homofermentatif menghasilkan 2
molekul asam laktat dari heksosa apapun yang dapat difermentasi, termasuk fruktosa. BAL homofermentatif menghasilkan asam laktat lebih banyak yang
dapat menurunkan pH.
Hasil pengukuran pH sebanding dengan hasil pengukuran TAT asam laktat. Pengukuran TAT asam laktat mengindikasikan banyaknya asam
laktat yang terbentuk. Semakin tinggi total asam yang terbentuk pada media menandakan semakin tingginya asam laktat yang dihasilkan oleh E. faecium
IS-27526, karena sifatnya homofermentatif, sehingga hampir seluruh produk fermentasi yang dibentuk adalah asam laktat. Hasil pengukuran TAT asam
laktat dapat dilihat pada Gambar 10.
Gambar 10 Pengaruh jenis prebiotik terhadap nilai TAT asam laktat media selama pertumbuhan E. faecium IS-27526
Nilai TAT asam laktat mendukung hasil absorbansi, hitungan cawan, dan pH media. Pertumbuhan optimum pada media m-MRSB +
Glukosa di jam ke-12 menunjukkan absorbansi dan log cfuml tertinggi. Pada kondisi ini diperoleh nilai pH terendah pH 4.7 dan nilai TAT asam laktat
tertinggi dibanding ketiga jenis media lainnya, yaitu sebesar 0.73 asam laktat. Nilai TAT asam laktat media mengalami penurunan, namun
cenderung statis hingga jam ke-24. Analisis statistik menunjukkan penurunan nilai TAT asam laktat setelah jam ke-12 ini tidak berbeda nyata. Hasil
analisis statistik nilai TAT asam laktat media selama pengujian pengaruh prebiotik terhadap E. faecium IS-27526 dapat dilihat pada Lampiran 19.
Pertumbuhan tertinggi E. faecium IS-27526 dalam media m-MRSB serta m-MRSB + Inulin terjadi pada jam ke-12. Media m-MRSB memiliki nilai pH
media dan TAT asam laktat masing-masing sebesar 7.5 dan 0.22 asam laktat. Media m-MRSB + Inulin memiliki nilai pH 7.3 dan TAT asam
laktat sebesar 0.18 asam laktat. Nilai TAT asam laktat pada media m-MRSB berkorelasi dengan
nilai pengukuran pH media. Analisis statistik menunjukkan nilai TAT asam laktat media m-MRSB tidak berbeda nyata dari jam ke-0 hingga jam
ke-24. Demikian halnya dengan nilai TAT asam laktat pada media m- MRSB + Inulin. Nilai TAT asam laktat kedua media ini tidak berbeda
nyata dalam analisis statistik dengan taraf signifikansi 5. Hasil pengukuran pH dan TAT asam laktat menunjukkan tidak
terjadi pembentukan asam laktat yang dapat menurunkan pH media m-MRSB dan m-MRSB + Inulin. Nilai TAT asam laktat tergolong rendah karena
tidak ada sumber karbon yang dapat difermentasi oleh E. faecium IS-27526 menjadi asam laktat dan terlihat bahwa inulin tidak dapat difermentasi oleh E.
faecium IS-27526. Media m-MRSB + FOS memiliki nilai pH 5.5 dan TAT asam laktat
sebesar 0.36 asam laktat pada pertumbuhan tertingginya di jam ke-8. Nilai pH mengalami perubahan hingga jam ke-24, namun analisis statistik
menunjukkan perubahan pH dari jam ke-8 hingga jam ke-24 tidak memiliki perbedaan nyata Lampiran 18. Demikian halnya dengan nilai TAT asam
laktat media m-MRSB + FOS yang tidak berbeda nyata dari jam ke-4 hingga jam ke-24 Lampiran 19.
Nilai pH dan TAT asam laktat media m-MRSB + FOS berbeda nyata dengan media kontrol m-MRSB. Hasil pengukuran pH dan TAT
asam laktat menunjukkan E. faecium IS-27526 mampu memfermentasi FOS sehingga menghasilkan asam laktat yang dapat menurunkan pH media.
Berbagai monosakarida dimetabolisme oleh BAL menjadi glukosa-6- fosfat atau fruktosa-6-fosfat dalam tahapan glikolisis atau jalur Embden
Meyerhoff Parnas EMP Surono, 2004b. FOS merupakan oligosakarida yang tersusun atas satu monomer glukosa dan monomer-monomer fruktosa
yang jumlahnya tergantung pada nilai derajat polimerisasi DP. FOS
memiliki DP antara 2 – 8 De Leenheer dan Hoebregs, 1994 dalam Franck dan De Leenheer, 2005.
FOS, yang dapat dipecah oleh enzim β-fruktosidase, akan menghasilkan
glukosa dan fruktosa. Molekul monosakarida ini akan masuk ke tahap glikolisis kemudian menghasilkan asam piruvat, 2 molekul adenosine
triphosphate ATP, dan 2 molekul NADH. Asam piruvat diubah oleh enzim laktat dehidrogenase menjadi asam laktat dengan mengubah 2 molekul NADH
menjadi 2 molekul NAD
+
. Prinsip fermentasi asam laktat adalah transfer H
+
dari NADH kepada gugus karbonil dari piruvat sehingga piruvat tereduksi menjadi laktat Bertolani, 2007.
Fermentasi asam laktat dengan memanfaatkan FOS yang dilakukan oleh E. faecium IS-27526 akan menghasilkan ATP. Peran ATP sangat penting
dalam proses pertumbuhan karena merupakan sumber energi dalam aktivitas sel, salah satunya adalah pertumbuhan Bertolani, 2007.
Hasil pengukuran hitungan cawan log cfuml, pH, dan TAT asam laktat pada media m-MRSB + FOS dapat dilihat pada Gambar 11. Selama
terjadi peningkatan pertumbuhan, media menunjukkan peningkatan TAT asam laktat sehingga media menjadi semakin asam dengan nilai pH yang
menurun. Peningkatan pertumbuhan E. faecium IS-27526 tertinggi pada waktu inkubasi 8 jam. Analisis statistik menunjukkan bahwa pada jam ke-8 jumlah
log cfuml E. faecium IS-27526 berbeda nyata dengan media kontrol m- MRSB, namun tidak berbeda dengan inulin Lampiran 17, walaupun
perbedaan di antara m-MRSB 8.1 log cfuml dan m-MRSB + Inulin 8.2 log cfuml hanya sedikit, yaitu 0.1 log cfuml.
Gambar 11 Pengaruh prebiotik FOS terhadap pertumbuhan E. faecium IS-
27526 log cfuml, pH media, serta nilai TAT asam laktat E. faecium IS-27526 dapat memanfaatkan FOS untuk difermentasi
membentuk asam laktat yang menurunkan pH media dan meningkatkan TAT asam laktat. Selain itu, ATP yang umum dihasilkan saat fermentasi dapat
digunakan untuk mendukung aktivitas pertumbuhannya hingga mencapai jumlah sel tertinggi sebesar 8.8 log cfuml pada waktu inkubasi 8 jam.
Penelitian oleh Audisio et al. 2001 melihat efek prebiotik dari berbagai sumber gula terhadap E. faecium CRL1385. Hasil pertumbuhan E. faecium
CRL1385 tidak berbeda nyata pada taraf signifikansi 5 di antara kontrol tanpa sumber karbon, penambahan gula putih, penambahan gula merah, serta
penambahan glukosa. Mekanisme pemanfaatan prebiotik dalam fermentasi masih belum
dikemukakan secara jelas. Namun penelitian Barrangou et al. 2003 dalam Saulnier et al. 2007 telah menunjukkan adanya peran dari fruktofuranosidase
dalam hidrolisis
FOS pada L.
acidophillus. Gen
pengkodean dari
fruktofuranosidase berasosiasi dengan gen untuk sistem transpor ATP Binding Cassette ABC. Pada penelitian ini, L. acidophillus mampu memanfaatkan
prebiotik FOS.
Penelitian Kaplan dan Hutkins 2003 dalam Saulnier et al. 2007 menyimpulkan bahwa L. paracasei dapat memanfaatkan FOS dengan
implikasi sistem transpor yang bersifat dependen terhadap keberadaan ATP. Saulnier et al. 2007 meneliti lebih dalam dan menyatakan bahwa proses
degradasi prebiotik FOS melibatkan tiga gen yaitu sistem transpor fosfoenolpiruvat PTS sukrosa,
β-fruktofuranosidase, dan fruktokinase.
C. Pengaruh Prebiotik terhadap Pertumbuhan L. plantarum IS-10506
