17
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Tempat Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.2 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimental. Metode penelitian meliputi pengumpulan sampel, pembuatan simplisia, pemeriksaan karakteristik
simplisia, pembuatan ekstrak etanol dari simplisia secara maserasi, pengujian golongan senyawa kimia terhadap simplisia dan ekstrak etanol daun nipah,
pembuatan larutan uji ekstrak etanol daun nipah dengan berbagai konsentrasi dan pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol daun nipah terhadap bakteri
gram positif yaitu Staphylococcus aureus dan bakteri gram negatif yaitu Escherichia coli.
3.3 Alat dan Bahan
3.3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, alumunium foil, autoklaf Fison, blender, bunsen, cawan petri, desikator,
inkubator Memmert, jangka sorong, jarum ose, kapas steril, kertas perkamen, laminar airflow cabinet Astec HLF 1200 L, lemari pendingin Toshiba, lemari
spengering, mikro pipet Eppendorf, neraca analitik Metler AE 200, oven Gallenkomp, penangas air, pencadang kertas, pinset, pipet tetes, rotary
18
evaporator, spatula, seperangkat alat destilasi, spektrofotometer visible Dynamika Halo Vis-10.
3.3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah amil alkohol, alfa-naftol, asam asetat glasial, asam sulfat, asam klorida, aquadest, besi III
klorida, bismuth III nitrat, etanol 96, eter, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium klorida, natrium
sulfat anhidrat, raksa II klorida, serbuk magnesium, serbuk zinkum, simplisia daun nipah Nypa fruticans Wurmb, timbal II asetat. Bakteri yang digunakan
adalah Staphylococcus aureus ATCC 6538dan Escherichia coli ATCC 8939.
3.4 Penyediaan Sampel
3.4.1 Pengambilan sampel
Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang
digunakan adalah daun nipah muda yang berwarna kuning, yang diambil di jalan Chinghuan, Desa Payabakong, Kecamatan Medan Labuhan, Sumatera Utara.
3.4.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Bogor.
3.4.3 Pengolahan sampel
Daun nipah yang telah dikumpulkan, dibuang lidinya, dicuci bersih dengan air mengalir, ditiriskan, lalu ditimbang berat basah, kemudian
dikeringkan di dalam lemari pengering dengan suhu 40-50°C. Daun dianggap kering bila dapat diremas rapuh dan hancur, lalu ditimbang berat kering.
19
Kemudian diserbukkan dengan menggunakan blender, disimpan di dalam wadah kering dan terlindung dari cahaya matahari.
3.5 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
2.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun nipah dengan mengamati bentuk, bau, rasa dan warna.
2.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun nipah. Serbuk simplisia ditaburkan di atas objek glass yang telah ditetesi dengan larutan
kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop.
2.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode azeotropi destilasi toluena. Cara penetapan: kedalam labu alas bulat dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air
suling, lalu didestilasi selama 2 jam. Toluena dibiarkan mendingin selama 30 menit dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml,
kemudian kedalam labu tersebut dimasukkan 5 g simplisia yang telah ditimbang seksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Kecepatan tetesan diatur
lebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian air terdestilasi, kemudian dinaikkan kecepatan tetesan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air
terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena yang telah jenuh. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan
mendingin sampai suhu kamar, sehingga air dan toluena memisah sempurna. Volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca
20
sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1998.
2.5.4 Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air- kloroform 2,5 ml kloroform dalam aquadest sampai 1 liter dengan menggunakan
botol bersumbat sambil sekali-kali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat diuapkan hingga
kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105°C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari
yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
2.5.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 95 dengan menggunakan botol bersumbat sambil sekali-kali dikocok
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah
dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105°C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang
telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.
2.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan kedalam kurs porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Kurs porselin bersama isinya dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, ditimbang sampai diperoleh bobot yang tetap. Kadar abu
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.
21
2.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, kemudian disaring dengan kertas saring, lalu dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan sampai diperoleh bobot tetap,
didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes
RI, 1995.
3.6 Pembuatan Larutan Pereaksi
3.6.1 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 g bismuth II nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat. Sebanyak 27,2 g kalium iodida ditimbang dan dilarutkan
dalam 50 ml air suling. Kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan air suling
hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
3.6.2 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam 20 ml air suling, kemudian ditambahkan sedikit demi sedikit 2 g iodium dan dicukupkan dengan air suling
hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
3.6.3 Pereaksi Meyer
Sebanyak 1,36 g raksa II klorida, dilarutkan dalam 60 ml air suling, kemudian pada wadah lain sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10 ml
air suling. Kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1980.
22
3.6.4 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g alfa-naftol ditambahkan beberapa tetes etanol kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.6.5 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.6.6 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,4 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.6.7 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.6.8 Pereaksi Lieberman-Burchard
Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrat dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat dan 50 bagian kloroform, harus dibuat baru Harborne, 1987.
3.6.9 Pereaksi besi III klorida 1 bv
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.6.10 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.6.11 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes RI, 1995.
23
3.7 Uji Golongan Senyawa Kimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan alkaloid, glikosida, steroidtriterpenoid, flavonoid, saponin, tanin dan glikosida antrakinon.
3.7.1 Pemeriksaan alkaloid
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan
disaring. Filtrat dipakai untuk uji alkaloid sebagai berikut: a.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi
Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman. c.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan berwarna merah atau jingga.
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan diatas Depkes RI, 1995.
3.7.2 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia, disari dengan 30 ml campuran etanol 96 dengan air suling 7:3 direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada
20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran
isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Kumpulan sari pelarut organik ditambahkan natrium sulfat anhidrat, disaring, kemudian
diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50°C, sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sari air dimasukkan kedalam tabung reaksi selanjutnya diuapkan
24
di atas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes larutan pereaksi molish, ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung,
terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya glikosida Depkes RI, 1995.
3.7.3 Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, kedalam 5 ml filtrat
ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna
merah atau kuning jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.7.4 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil
sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1 . Jika terjadi warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya tanin Fansworth, 1966.
3.7.5 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10
detik, jika terbentuk buih setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N
menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1995.
3.7.6 Pemeriksaan antrakinon
Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N dipanaskan, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan didiamkan.
25
Lapisan benzen dipisahkan dan disaring. Lapisan benzen dikocok dengan 2 ml natrium hidroksida 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan
benzen tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon Depkes RI, 1995.
3.7.7 Pemeriksaan steroidtriterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan 20
tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Lieberman- Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru
kehijauan menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Harborne, 1987.
3.8 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Nipah
Sebanyak 300 g serbuk simplisia dimasukkan kedalam sebuah bejana, dituangi 75 bagian etanol 96, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari
cahaya sambil sering diaduk, kemudian diserkai, dan diperas. Dicuci ampas dengan etanol 96 secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Dipindahkan ke
dalam bejana bertutup, dibiarkan ditempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari. Dienap tuangkan atau disaring Ditjen POM, 1979. Maserat yang diperoleh
dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada temperatur ± 40°C sampai diperoleh ekstrak kental.
3.9 Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di dalam oven pada
suhu 170°C selama 1-2 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan cara dibakar dengan nyala
bunsen Lay, 1994.
26
3.10 Pembuatan Media
3.10.1 Pembuatan media nutrien agar
Komposisi: Lab-lemco powder
1,0 g Yeast extract
2,0 g Peptone
5,0 g Sodium chloride
5,0 g Agar
15 g Cara Pembuatan:
Sebanyak 23 g media nutrient agar ditimbang dan dimasukkan kedalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan air suling sebanyak 1000 ml, lalu dipanaskan
sampai larut. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Oxoid, 1982.
3.10.2 Pembuatan nutrient broth
Komposisi : Lab-lemco powder
1,0 g Yeast extract
2,0 g Peptone
5,0 g Sodium chloride
5,0 g Cara pembuatan:
Sebanyak 13,0 g media nutrient broth yang sudah jadi ditimbang dan dilarutkan dengan air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna.
Media dimasukkan dalam erlenmeyer steril yang bertutup dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Oxoid, 1982.
27
3.10.3 Pembuatan agar miring
Sebanyak 3 ml media nutrient agar cair, yang telah dibuat dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diletakkan pada sudut kemiringan 30-45
o
dan dibiarkan hingga media memadat, kemudian disimpan di lemari pendingin Lay,
1994.
3.11 Pembiakan Bakteri 3.11.1 Pembuatan stok kultur bakteri
3.11.1.1 Pembuatan stok kultur bakteri Staphylococcus aureus
Satu koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dengan menggunakan jarum ose steril lalu ditanamkan pada media nutrient agar miring dengan cara
menggores, setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37°C selama 18-24 jam Ditjen POM, 1995.
3.11.1.2 Pembuatan stok kultur bakteri Escherichia coli
Satu koloni bakteri Escherichia coli diambil dengan menggunakan jarum ose steril lalu ditanamkan pada media nutrient agar miring dengan cara
menggores, setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37°C selama 18-24 jam Ditjen POM, 1995.
3.11.2 Pembuatan inokulum bakteri
3.11.2.1 Pembuatan inokulum bakteri Staphylococcus aureus
Dari stok kultur bakteri Staphylococcus aureus yang telah tumbuh diambil dengan jarum ose steril lalu disuspensikan dalam tabung yang berisi 10 ml larutan
nutrient broth. Diukur kekeruhan larutan dengan menggunakan alat spektrofotometer visible pada panjang gelombang 580 nm hingga diperoleh
transmitan 25 Ditjen POM, 1995.
28
3.11.2.2 Pembuatan inokulum bakteri Escherichia coli
Dari stok kultur bakteri Escherichia coli yang telah tumbuh diambil dengan jarum ose steril lalu disuspensikan dalam tabung yang berisi 10 ml larutan nutrient
broth. Diukur kekeruhan larutan dengan menggunakan alat spektrofotometer visible pada panjang gelombang 580 nm hingga diperoleh transmitan 25 Ditjen
POM, 1995.
3.12 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Etanol Daun Nipah dengan Berbagai
Konsentrasi
Ditimbang sebanyak 5 g ekstrak etanol daun nipah dilarutkan dengan pelarut DMSO hingga 10 ml. Konsentrasi larutan uji ekstrak etanol adalah 500
mgml. Dibuat pengenceran sampai diperoleh larutan uji ekstrak etanol dengan konsentrasi 400 mgml, 300 mgml, 200 mgml, 100 mgml, 75 mgml, 50 mgml,
25 mgml, 12,5 mgml dan 6,25 mgml.
3.13 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Nipah
Kategori