Gugus fungsi yang menyerap radiasi di daerah ultraviolet dekat dan daerah tampak disebut kromofor dan hampir semua kromofor mempunyai ikatan tak
jenuh. Pada kromofor jenis ini transisi terjadi dari π → π
, yang menyerap pada λ
max
kecil dari 200 nm tidak terkonyugasi, misalnya pada C=C dan -C≡C-.
Khromofor ini merupakan tipe transisi dari sistem yang mengandung elektron π
pada orbital molekulnya. Untuk senyawa yang mempunyai sistem konyugasi, perbedaan energi antara keadaan dasar dan keadaan tereksitasi menjadi lebih kecil
sehingga penyerapan terjadi pada panjang gelombang yang lebih besar. Gugus fungsi seperti –OH, -NH
2
dan –Cl yang mempunyai elektron- elektron valensi bukan ikatan disebut auksokrom yang tidak menyerap radiasi
pada panjang gelombang lebih besar dari 200 nm, tetapi menyerap kuat pada daerah ultraviolet jauh. Bila suatu auksokrom terikat pada suatu kromofor, maka
pita serapan kromofor bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang efek batokrom dengan intensitas yang lebih kuat. Efek hipsokrom adalah suatu
pergeseran pita serapan ke panjang gelombang lebih pendek, yang sering kali terjadi bila muatan positif dimasukkan ke dalam molekul dan bila pelarut berubah
dari non polar ke pelarut polar Noerdin, 1985; Dachriyanus, 2004.
2.2.2 Hukum Lambert Beer
Menurut Hukum Lambert, serapan berbanding lurus terhadap ketebalan sel yang disinari. Menurut Hukum Beer, yang hanya berlaku untuk cahaya
monokromatik dan larutan yang sangat encer, serapan berbanding lurus dengan konsentrasi banyak molekul zat. Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu
dalam Hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dapat ditulis dalam persamaan:
Universitas Sumatera Utara
A = a . b . C Dimana: A = serapan tanpa dimensi
a = absorptivitas l g
-1
cm
-1
b = ketebalan sel cm C = konsentrasig. l
-1
Jadi dengan Hukum Lambert-Beer konsentrasi dapat dihitung dari ketebalan sel dan serapan. Absorptivitas merupakan suatu tetapan dan spesifik
untuk setiap molekul pada panjang gelombang dan pelarut tertentu. Menurut Roth dan Blaschke 1981, absorptivitas spesifik juga sering
digunakan sebagai ganti absorptivitas. Harga ini memberikan serapan larutan 1 bv dengan ketebalan sel 1 cm, sehingga dapat diperoleh persamaan:
A =
1 1
A . b . C Dimana:
1 1
A = absorptivitas spesifik ml g
-1
cm
-1
b = ketebalan sel cm C = konsentrasi senyawa terlarut g100 ml larutan
2.2.3 Penggunaan Spektrofotometri Ultraviolet
Pada umumnya spektrofotometri ultraviolet dalam analisis senyawa organik digunakan untuk:
1. Menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang terkonyugasi dan
auksokrom dari suatu senyawa organik 2.
Menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang serapan maksimum suatu senyawa
3. Mampu menganalisis senyawa organik secara kuantitatif dengan
menggunakan hukum Lambert-Beer Dachriyanus, 2004.
Universitas Sumatera Utara
Analisis kualitatif
Kegunaan spektrofotometri ultraviolet dalam analisis kualitatif sangat terbatas, karena rentang daerah radiasi yang relatif sempit hanya dapat
mengakomodasi sedikit sekali puncak absorpsi maksimum dan minimum, karena itu identifikasi senyawa yang tidak diketahui, tidak memungkinkan.
Penggunaannya terbatas pada konfirmasi identitas dengan menggunakan parameter panjang gelombang puncak absorpsi maksimum,
λ
max
, nilai absorptivitas, a, nilai absorptivitas molar,
ε, atau nilai ekstingsi, A
1, 1 cm
, yang spesifik untuk suatu senyawa yang dilarutkan dalam suatu pelarut dan pH tertentu
Satiadarma, 2002.
Analisis Kuantitatif
Penggunaan utama spektrofotometri ultraviolet adalah dalam analisis kuantitatif. Apabila dalam alur spektrofotometer terdapat senyawa yang
mengabsorpsi radiasi, akan terjadi pengurangan kekuatan radiasi yang mencapai detektor. Parameter kekuatan energi radiasi khas yang diabsorpsi oleh molekul
adalah absorban A yang dalam batas konsentrasi rendah nilainya sebanding dengan banyaknya molekul yang mengabsorpsi radiasi dan merupakan dasar
analisis kuantitatif. Penentuan kadar senyawa organik yang mempunyai gugus khromofor dan mengabsorpsi radiasi ultraviolet-sinar tampak, penggunaannya
cukup luas. Konsentrasi kerja larutan analit umumnya 10 sampai 20 µgml, tetapi
untuk senyawa yang nilai absorptivitasnya besar dapat diukur pada konsentrasi yang lebih rendah. Senyawa yang tidak mengabsorpsi radiasi ultraviolet-sinar
tampak dapat juga ditentukan dengan spektrofotometri ultraviolet-sinar tampak,
Universitas Sumatera Utara
apabila ada reaksi kimia yang dapat mengubahnya menjadi khromofor atau dapat disambungkan dengan suatu pereaksi khromofor Satiadarma, 2004.
Analisis kuantitatif dengan metode Spektrofotometri UV dapat digolongkan atas beberapa pelaksanaan pekerjaan, yaitu;
1. Analisis kuantitatif zat tunggal analisis satu komponen
a. Metode Regresi
Analisis kuantitatif dengan metode regresi yaitu dengan menggunakan persamaan garis regresi yang didasarkan pada harga serapan dan konsentrasi
standar yang dibuat dalam beberapa konsentrasi, paling sedikit menggunakan 5 rentang konsentrasi yang meningkat yang dapat memberikan serapan yang linier,
kemudian diplot menghasilkan suatu kurva yang disebut dengan kurva kalibrasi. Konsentrasi suatu sampel dapat dihitung berdasarkan kurva tersebut.
b. Metode Pendekatan
Analisis kuantitatif dengan cara ini dilakukan dengan membandingkan serapan standar yang konsentrasinya diketahui dengan serapan sampel. Syarat
cara pendekatan yaitu serapan sampel tidak jauh berbeda dengan serapan baku pembanding. Konsentrasi sampel C
s
dihitung dengan rumus: A
P
= a. b. C
p
A
s
= a. b. C
s
Keterangan: A
p
= Absorbansi baku pembanding As
= Absorbansi sampel C
p
= Konsentrasi baku pembanding Cs
= Konsentrasi sampel Holme dan Peck, 1983.
Universitas Sumatera Utara
2. Analisis Kuantitatif Campuran Dua Macam Komponen atau Lebih
Analisis campuran dua atau lebih bahan kadang-kadang ditentukan secara simultan dalam sekali pengamatan tanpa dipisahkan. Hal ini didasarkan pada
asumsi bahwa absorbansi total dari campuran komponen merupakan jumlah serapan masing-masing komponen tersebut.
Ada tiga kemungkinan analisis campuran dua komponen atau lebih, yaitu; a.
Spektrum tanpa tumpang tindih Overlap Spektrum tidak saling tumpang tindih memungkinkan untuk menemukan
suatu panjang gelombang dimana X menyerap dan Y tidak menyerap, serta panjang gelombang serapan maksimum dimana Y menyerap dan X tidak
menyerap Gambar 1. Komponen X dan Y masing- masing diukur pada λ
1
dan λ
2
.
Gambar 1. Spektrum absorpsi senyawa X dan Y tidak ada tumpang tindih
pada pada kedua panjang gelombang yang digunakan b.
Spektrum tumpang tindih satu arah Spektrum dari X dan Y tumpang tindih satu arah Gambar 2. Y tidak
mengganggu pengukuran X pada λ
1
tetapi X menyerap cukup banyak bersama –
sama dengan Y pada λ
2
. Pemecahan masalah ini pada prinsipnya cukup
Universitas Sumatera Utara
sederhana. Konsentrasi X ditetapkan langsung dari serapan larutan pada λ
1
. Kemudian serapan yang diberikan o
leh konsentrasi X pada λ
2
dihitung dari absorptivitas molar X pada λ
2
yang sebelumnya telah diketahui. Serapan ini dikurangkan dari serapan terukur larutan pada λ
2
sehingga diperoleh serapan yang disebabkan oleh komponen Y. Kemudian konsentrasi Y dapat dihitung
dengan cara yang biasa.
Gambar 2. Spektrum absorbs senyawa X dan Y tumpang tindih satu arah, X
dapat diukur tanpa gangguan Y, tetapi X mengganggu pada pengukuran langsung dari Y.
c. Spektrum tumpang tindih dua arah
Spektrum dari X dan Y saling tumpang tindih dua arah Gambar 3, pada keadaan ini tidak ada panjang gelombang serapan maksimum dimana X dan Y
menyerap tanpa gangguan. Maka perlu penyelesaian dua persamaan dengan dua variabel yang tidak diketahui. Hal ini karena serapan total dari campuran
beberapa komponen merupakan jumlah serapan masing-masing komponen tersebut. Sehingga konsentrasi X dan Y yang belum diketahui dalam kedua
persamaan dapat diukur dengan mudah. Dengan ditentukan bila nilai-nilai absorptivitas molar ε harus diketahui dari pengukuran terhadap larutan murni
Universitas Sumatera Utara
komponen X dan Y pada kedua panjang gelombang itu. Pada perinsipnya persamaan-persamaan dapat disusun untuk berbagai komponen, asal nilai
absorbansi diukur pada panjang gelombang yang sama banyak dengan komponen itu.
Gambar 3. Spektrum absorbsi X dan Y tumpang tindih dua arah. Tidak ada
panjang gelombang dimana masing-masing senyawa dapat diukur tanpa mengalami gangguan oleh yang lainnya
Day and Underwood, 1999
2.2.4 Peralatan Untuk Spektrofotometri
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitans atau serapan suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Alat ini terdiri dari spektrometer
yang menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer sebagai alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorpsi Khopkar, 1990; Day and Underwood, 1999. Unsur-unsur terpenting suatu spektrofotometer ditunjukkan secara skematik dalam
gambar berikut:
Universitas Sumatera Utara
Keterangan Gambar : 1.
Suatu sumber energi radiasi yang berkesinambungan yang meliputi daerah spektrum, dimana instrumen itu dirancang untuk beroperasi.
2. Monokromator, yang merupakan suatu alat untuk mengisolasi suatu berkas
sempit cahaya pada panjang gelombang tertentu dari spektrum luas yang dipancarkan oleh sumber.
3. Kuvet sebagai wadah untuk sampel.
4. Detektor yang merupakan suatu transducer yang mengubah energi radiasi
menjadi isyarat listrik sehingga dapat mendeteksi sinyal yang dipancarkan. 5.
Suatu amplifier penguat dan rangkaian yang berkaitan yang membuat isyarat listrik dapat untuk diamati.
6. Sistem pembacaan yang memperlihatkan besarnya isyarat listrik.
Day and Underwood, 1999
2.3 Validasi
Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan untuk penggunaannya Harmita, 2004. Sumber
Monokromator Kuvet
Detektor
Penguat
Pembacaan, pengamatan
Bagian optik Bagian listrik
1 2
3 4
5
6
Universitas Sumatera Utara
