14
3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April sampai Mei 2011, bertempat di Laboratorium Biokimia Hasil Perikanan, Laboratorium Mikrobiologi Hasil
Perikanan, dan Laboratorium Organoleptik, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi steroform, plastik, baskom, botol aqua bekas, saringan, nampan kecil, talenan, pisau, pinset, gunting,
alumunium foil, magnet stirrer, kertas label, kapas, kertas saring, plastik wrapping, form penilaian organoleptik, dan alat-alat analisis yang meliputi gelas
piala, gelas ukur, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet, cawan porselen kecil, kompor listrik, desikator, oven, tanur pengabuan, alat homogenizer, pH-meter, cawan
porselen, mortar, rak tabung reaksi, sudip, bunsen, pipet mikro, tip, vortex, inkubator, labu kjehdahl, alat destilasi, selongsong lemak, tabung soxhlet, dan
labu lemak. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging ayam segar
yang dibeli dari Pasar Tradisional Gunung Batu-Bogor, serbuk kitosan, asam asetat 1,5, aquades, larutan garam fisiologis, media Nutrient Agar, cairan
spirtus, garam NaCl, K
2
SO
4
, HgO, H
2
SO
4
, tablet kjehdahl, NaOH 40 , H
3
BO
3
, cairan indikator campuran metil merah 0,2 dalam alkohol dan metilen blue
0,2 dalam alkohol dengan perbandingan 2:1, dan pelarut heksana.
3.3 Metode Penelitian
Aplikasi pengawetan kitosan pada daging ayam segar dilakukan melalui empat tahap, yaitu tahap persiapan, tahap perendaman, penyimpanan, dan tahap
pengujian. Tahap persiapan dilakukan dengan cara menyiapkan semua bahan- bahan dan alat-alat yang akan digunakan dalam tahap perendaman, penyimpanan
dan tahap pengujian. Tahap perendaman dilakukan dengan cara merendam daging ayam segar dalam beberapa perlakuan konsentrasi larutan kitosan, yaitu
konsentrasi 0 kontrol, 0,5 ; 1 ; dan 1,5 , dengan jumlah larutan kitosan
15 yang digunakan sebanyak ± 1,5 liter, dan setelah itu dilakukan tahap penyimpanan
daging ayam dalam suhu ruang dalam keadaan terbuka dengan berbagai perlakuan lama penyimpanan 0 jam, 3 jam, 6 jam, dan 9 jam. Tahap pengujian yang
dilakukan, diantaranya yaitu pengujian organoleptik, penentuan nilai total koloni bakteri yang tumbuh selama penyimpanan Total Plate Count; pengukuran nilai
derajat keasaman pH, dan analisis proksimat daging, yang meliputi uji kadar air, kadar abu, kadar lemak, dan kadar protein. Penelitian ini dilakukan untuk
mengetahui pengaruh konsentrasi larutan kitosan yang paling optimal dalam memperpanjang daya awet daging ayam segar. Tahapan penelitian dapat dilihat
pada Lampiran 1. 3.3.1 Tahap persiapan
Tahap persiapan diawali dengan pembelian 4 ekor daging ayam segar di Pasar Tradisional Gunung Batu, Bogor. Proses pembelian sampai ke dalam proses
persiapan yang dilakukan di dalam Laboratorium dilakukan secara aseptik atau steril dan terkontrol, diantaranya dengan membungkus setiap potong daging ayam
dalam plastik steril dan menyimpannya di dalam box steroform yang telah berisi es yang digunakan untuk mempertahankan suhu daging ayam. Daging ayam yang
digunakan dalam penelitian ini berjumlah ± 24 potong ayam untuk 4 perlakuan. Sebanyak 6 potong daging ayam digunakan untuk setiap perlakuan. Bahan-bahan
dan alat-alat juga disiapkan menurut tahapan penelitian agar tidak tertukar selama jalannya penelitian.
3.3.2 Tahap perendaman Daging ayam untuk setiap perlakuan, dalam tahap perendaman ini
direndam selama 3 menit, kecuali untuk daging ayam tanpa perlakuan konsentrasi kitosan. Waktu perendaman 3 menit merupakan waktu yang optimal untuk
perendaman karena tidak merusak tekstur, bau, dan penampakan, dengan nilai organoleptik masih di atas nilai yang ditetapkan Badan Standarisasi Nasional
Kurnianingrum 2008. Setiap potongan daging ayam yang sudah direndam, ditiriskan dengan menggunakan wadah saringan, lalu setelah itu disimpan untuk
tahapan selanjutnya.
16 3.3.3 Tahap penyimpanan
Daging ayam yang sudah ditiriskan, kemudian disimpan dalam nampan- nampan kecil pada suhu ruang 25-30 ºC selama 9 jam dalam keadaan terbuka.
Percobaan dilakukan sebanyak dua kali ulangan dengan selang pengamatan untuk uji organoleptik, uji Total Plate Count TPC, uji derajat keasaman pH, dan
analisis proksimat setiap 3 jam sekali sampai 9 jam lama penyimpanan. 3.3.4 Tahap pengujian
Tahap pengujian terhadap sampel dilakukan secara subyektif sensori dan obyektif non sensori. Pengujian secara subyektif terhadap sampel dilakukan
dengan menggunakan uji organoleptik menggunakan scoresheet penilaian terhadap sampel daging ayam, sedangkan untuk pengujian obyektif menggunakan
pengukuran nilai derajat keasaman pH, penghitungan nilai koloni total bakteri atau Total Plate Count TPC, dan analisis proksimat yang terdiri atas pengujian
kadar air, kadar abu, kadar protein, dan kadar lemak. 3.3.4.1 Uji organoleptik
Pengujian organoleptik dilakukan setiap selang waktu 3 jam oleh 6 orang panelis tetap. Jumlah panelis standar yang terlibat untuk satu kali pengujian
adalah 6 orang BSN 2006. Penilaian indrawi ini dilakukan terhadap beberapa parameter uji, yaitu parameter penampakan, warna, bau, lendir, dan tekstur.
Potongan daging ayam yang diuji secara organoleptik diberi nilai berdasarkan penilaian penelis dan dituangkan dalam lembaran scoresheet penilaian dalam
skala 1 satu sebagai nilai terendah dan angka 4 empat sebagai nilai tertinggi. Adapun contoh form penilaian scoresheet beserta keterangannya dapat dilihat
pada Lampiran 2. 3.3.4.2 Pengukuran Nilai pH AOAC 1995
Sebanyak 10 gram sampel dihancurkan terlebih dahulu dengan menggunakan alat homogenizer dan selanjutnya dihomogenisasikan dengan 90 ml
aquades. Larutan homogen tersebut diukur dengan pH meter yang sudah dikalibrasi dengan larutan buffer standar pH 4 dan 7. Kestabilan nilai yang
17 ditunjukkan oleh pH meter merupakan nilai hasil pengukuran derajat keasaman
pH sampel. 3.3.4.3 Perhitungan nilai Total Plate Count TPC Fardiaz 1992
Prinsip kerja dari metode perhitungan TPC ini adalah penghitungan jumlah koloni bakteri yang terkandung dalam sampel dengan perlakukan
pengenceran dan dilakukan secara duplo. Seluruh pekerjaan dilakukan secara aseptik untuk mencegah kontaminasi yang tidak diinginkan dan pengamatan
secara duplo dapat meningkatkan ketelitian. Jumlah koloni bakteri yang dapat dihitung adalah cawan petri yang mempunyai koloni bakteri antara 30-300 koloni.
Cawan petri, tabung reaksi, dan pipet sebelum digunakan disterilkan terlebih dahulu dalam oven pada suhu 180 ºC selama 2 jam. Media disterilkan
dalam autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Setelah disterilisasi, untuk menjaga agar media tidak membeku, suhu media dipertahankan
pada suhu 45-55 ºC dalam penangas air. Pembuatan larutan garam fisiologis dilakukan dengan cara melarutkan 8,5 gram NaCl dalam 1 liter aquades yang
kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit. Pembuatan larutan contoh dilakukan dengan mencampurkan 10 gram
sampel yang sebelumnya dihaluskan terlebih dahulu, dalam larutan pengencer steril 90 ml sampai homogen sehingga didapatkan pengenceran 10
-1
. Pengenceran selanjutnya dilakukan dengan cara, sebanyak 1 ml larutan contoh homogen yang
diambil dengan menggunakan pipet steril, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan pengencer steril dan dihomogenisasikan kembali untuk
memperoleh pengenceran 10
-2
. Begitupun seterusnya sampai pengenceran dilakukan hingga tingkat pengenceran 10
-5
. Sebanyak 1 ml dari dari setiap tabung reaksi pengenceran dipipet
sebanyak 1 ml larutan contoh dan dipindahkan ke dalam cawan petri steril dan kemudian dicampurkan dengan menggunakan media NA 10 ml, lalu disebar
secara merata. Setiap perlakuan pemindahan ke dalam media NA ini dilakukan secara duplo atau dua kali ulangan. Setiap cawan digerak-gerakkan secara
melingkar di atas meja sampai media NA merata. Setelah agar mengeras, cawan petri diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35 ºC dengan posisi terbalik selama
48 jam.
18 Koloni yang tumbuh setelah masa inkubasi, dihitung dan dinyatakan
sebagai jumlah colony forming unit cfu per gram atau koloni per gram berdasarkan Standar Plate Count SPC, dengan jumlah koloni yang dapat
diterima 30-300 koloni per cawan. Jumlah koloni dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Data yang dilaporkan sebagai Standard Plate Count SPC harus
mengikuti syarat-syarat sebagai berikut: 1
Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama dan kedua. Jika angka ketiga sama dengan atau lebih besar dari lima, harus
dibulatkan satu angka lebih tinggi dari angka kedua. 2
Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan kurang dari 30 koloni pada cawan petri, hanya koloni pada pengenceran terendah
yang dihitung, hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan faktor pengencer, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan.
3 Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan lebih
dari 300 koloni, hanya jumlah koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan faktor
pengencer. 4
Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30-300, dimana perbandingan antara jumlah koloni tertinggi dan
terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih dari satu atau sama dengan dua, maka tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan
memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan antara nilai tertinggi dan nilai terendah lebih besar dari dua, maka yang dilaporkan hanya hasil nilai
terkecil. 5
Jika digunakan dua cawan petri duplo pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut.
Koloni per ml atau per gr = Jumlah koloni per cawan x
19 3.3.4.4 Kadar air AOAC 2005
Kadar air sampel ditentukan pada berat contoh sebelum dan sesudah dikeringkan. Cawan kosong dikeringkan di dalam oven selama 15 menit atau
sampai berat tetap pada suhu 105 ºC, kemudian didinginkan di dalam desikator selama 30 menit. Setelah didinginkan, cawan ditimbang. Sampel sebanyak 5 gram
ditimbang dan diletakkan ke dalam cawan, lalu dipanaskan di dalam oven pada suhu 105-110 ºC selama 3-4 jam dan kemudian cawan didinginkan di dalam
desikator selama 30 menit dan selanjutnya ditimbang kembali. Penentuan kadar air berat basah dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan:
B : Berat sampel awal gram B1 : Berat sampel + cawan sebelum dikeringkan gram
B2 : Berat sampel + cawan setelah dikeringkan gram
3.3.4.5 Kadar abu AOAC 2005 Cawan sebelum digunakan, dibersihkan terlebih dahulu, kemudian
dikeringkan di dalam oven selama 15 menit pada suhu 105 ºC. Setelah dikeringkan, cawan didinginkan di dalam desikator selama 30 menit dan
kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 5 gram ditempatkan dalam cawan dan kemudian dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 60-105 ºC selama 6 jam.
Kemudian sampel yang sudah kering dibakar menggunakan hotplate sampai tidak berasap selama ± 20 menit. Tahap selanjutnya, cawan dimasukkan ke dalam tanur
pengabuan dengan suhu 600 ºC, kemudian dibakar selama 6 jam. Setelah selesai pengabuan, cawan didinginkan di dalam desikator lalu ditimbang. Penentuan
kadar abu dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan: A : berat abu gram
B : berat sampel gram
20
3.3.4.6 Kadar protein AOAC 2005 Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode kjeldahl mikro. Sampel
sebanyak 1 gram dimasukkan ke dalam labu kjehdahl 30 ml. Kemudian ditambahkan K
2
SO
4
1,9 gram, HgO 40 mg, H
2
SO
4
2,5 ml, serta beberapa tablet kjehdahl. Sampel kemudian dididihkan sampai berwarna jernih selama
kurang lebih 1-1,5 jam dan selanjutnya dibiarkan sampai dingin lalu dipindahkan ke dalam alat destilasi. Setelah pemindahan ke dalam alat destilasi, labu kjeldahl
dibilas dengan aquades 20 ml sebanyak 5-6 kali, lalu hasil bilasan tersebut juga dimasukkan di bawah kondensor dengan ujung kondensor terendam di dalamnya
dan kemudian ke dalam tabung reaksi, ditambahkan larutan NaOH 40 sebanyak 20 ml. cairan dalam ujung kondensor ditampung dengan erlenmeyer 125 ml berisi
larutan H
3
BO
3
dan 3 tetes indikator campuran metil merah 0,2 dalam alkohol dan metilen blue 0,2 dalam alkohol dengan perbandingan 2:1 yang ada di
bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh kira-kira 200 ml destilat yang bercampur dengan H
3
BO
3
dan indikator dalam erlenmeyer. Lalu destilat tersebut dititrasi menggunakan larutan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna
menjadi merah. Hal yang sama dilakukan untuk blanko. Penentuan kadar protein dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
3.3.4.7 Kadar lemak AOAC 2005 Sampel daging ayam sebanyak 5 gram ditimbang dan dibungkus dengan
kertas saring, lalu diletakkan pada alat ekstraksi soxhlet yang dipasang di atas kondensor serta labu lemaknya diletakkan di bawahnya. Pelarut heksana
dituangkan ke dalam labu lemak secukupnya sesuai dengan ukuran soxhlet yang digunakan dan dilakukan refluks selama minimal 16 jam sampai pelarut turun
21 kembali ke dalam labu lemak. Pelarut di dalam labu lemak didestilasi dan
ditampung. Labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ºC selama 5 jam. Labu lemak kemudian didinginkan
dalam desikator selama 20-30 menit dan kemudian ditimbang. Penentuan kadar lemak dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
3.4 Analisis Data