III. METODOLOGI PENELITIAN A.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan untuk kultivasi PHA adalah bioreaktor skala 13 liter dengan volume kerja 10 liter, erlenmeyer, penyaring vakum, oven, shaking
waterbath , termometer, neraca analitik, rotary shaking inkubator, autoklaf, pH
meter, sentrifuse, homogenizer, refrigator, freezer, desikator, clean bench, aerator dan pipet mikro. Alat yang digunakan untuk casting bioplastik adalah plat kaca
dan alat tempat yang digunakan untuk menguapkan pelarut adalah lemari asap. Alat yang digunakan untuk pengujian biodegradasi bioplastik adalah botol yang
dirangkai menjadi biometer modifikasi dari Andrady, 2000. Alat yang digunakan untuk TPC Total Plate Count adalah cawan petri, mikro pipet, tabung
ulir, Colonimetri, inkubator dan autoklaf. Bahan-bahan untuk kultivasi bakteri dan isolasi PHA adalah nutrient
broth , NH
4 2
HPO
4
, K
2
HPO4, KH
2
PO
4
, MgSO
4
0,1 M, FeSO
4
.7H
2
O, MnCl
2
.4H
2
O, CoSO
4
.7H
2
0, CaCl
2
.7H
2
O, CuCl
2
.2H
2
O, ZnSO
4
.7H
2
O, buffer tris- hidroklorida, NaOH, NaOCl, NH
4
OH dan hidrolisat pati sagu. Proses kultivasi tersebut menggunakan strain Ralstonia eutropha IAM 12368 yang diperoleh dari
IAM Culture Collection, Institute of Molecular and Celular Bioscience, The University of Tokyo.
Bahan yang digunakan untuk media degradasi adalah tanah dengan penambahan lumpur dan tanah tanpa penambahan Lumpur yang berasal
dari daerah Cikabayan IPB Darmaga, urea dan K
2
HPO
4
. Bioplastik yang diujikan adalah PHA murni, PHA dengan pemlastis DMF, PEG dan DEG. Untuk bahan
analisis digunakan NaOH 0.1 N, HCl 0.1 N, nutrient agar NA dan aquades.
B. Metodologi
Sebelum digunakan, media tanah di uji terlebih dahulu untuk mengetahui pH dan jumlah mikroba yang ada di dalamnya. pH diukur dengan menggunakan
pH meter. Tanah yang berbentuk padat, diencerkan dengan perbandingan tanah:air yaitu sebesar 1:9 gr:ml supaya pH tanah dapat terbaca.
Jumlah mikroba dalam tanah dapat diketahui dengan metode TPC Total Plate Count
. TPC ini dilakukan dalam pengenceran ke 4. Tanah seberat 1 gram
yang akan dihitung bakterinya diencerkan terlebih dahulu ke dalam 9 ml aquades dalam tabung ulir yang telah disterilisasi. Pada pengenceran ke 4 diambil
sampelnya sebanyak 1 ml dan dituangkan ke dalam cawan petri, kemudian dimasukkan nutrient agar ke dalam cawan tersebut sehingga tercampur antara
sampel dan agar. Nutrient agar digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri yang akan dihitung. Cawan yang telah berisi sampel dan agar dimasukkan ke
dalam inkubator selama 48 jam. Pada jam ke 48, bakteri yang ada dalam cawan dihitung dengan menggunakan alat Colonimetri.
Bioplastik yang akan di uji biodegradasi adalah bioplastik PHA murni, PHA dengan pemlastis DMF, PHA dengan pemlastis DEG dan PHA dengan
pemlastis PEG. Bioplastik yang digunakan adalah hasil kultivasi PHA dan casting dari PHA yang ditambah pemlastis. Diagram alir proses kultivasi PHA dapat
dilihat pada Lampiran 1. Sebelum pembentukan plastik, untuk menghasilkan PHA dari cairan hasil kultivasi diperlukan proses hilir cairan kultivasi sehingga
menghasilkan PHA. Diagram alir proses hilir dapat dilihat pada Lampiran 2. Setelah dihasilkan PHA dari proses hilir, pembuatan bioplastik hasil perpaduan
antara PHA dengan pemlastis bisa dilakukan. Diagram alir proses pembuatan bioplastik dapat dilihat pada Lampiran 3.
Pengujian biodegradasi ini diawali dengan mempersiapkan terlebih dahulu media pendegradasi, kemudian menebarkannya ke dalam labu erlenmeyer agar
suhu, kelembaban, kadar oksigen, serta penyebaran mikroba merata di tiap bagian. Mikroba yang terdapat dalam media tersebut dapat dipercepat pertumbuhannya
dengan cara menambahkan urea dan K
2
HPO
4
sebesar 0,1 dan 0,05 dari bobot substrat bioplastik yang digunakan. Bioplastik yang diuji adalah bioplastik
berbobot ±0,1 gram. Bioplastik tersebut diletakkan diantara tumpukan media, sehingga diharapkan dapat didegradasi secara merata. Diagram alir pengujian
biodegradasi bioplastik dapat dilihat pada Lampiran 4. Penghitungan CO
2
hasil biodegradasi dapat dilakukan dengan menggunakan botol yang dirangkai menjadi biometer Andrady, 2000. Natrium
hidroksida NaOH 0,1 N sebanyak 50 ml ditempatkan dalam botol 1. Biodegradasi akan berlangsung dan menghasilkan CO
2
yang mengalir dari botol 2 yang berisi sampel dan media ke botol 1. Larutan NaOH dengan CO
2
pada botol
1 dianalisa untuk mengetahui jumlah CO
2
yang dihasilkan pada saat proses biodegradasi. Pengukuran CO
2
, yaitu dengan cara menambahkan 2 tetes indikator fenolpthalein PP ke dalam erlenmeyer yang berisi NaOH yang telah menangkap
CO
2
yang dihasilkan. Larutan HCl ditambahkan pada larutan tersebut sampai warna merah menghilang. Proses dilanjutkan dengan menambahkan 2 tetes
indikator metil jingga dan dititrasi kembali dengan HCl 0,1 N sampai warna kuning berubah menjadi merah muda. Jumlah HCl yang ditambahkan pada tahap
kedua titrasi berhubungan langsung dengan jumlah CO
2
yang difiksasi oleh larutan NaOH atau dihasilkan pada proses biodegradasi PHA. Setelah itu
dilakukan konversi ml HCl yang digunakan sebagai titran pada titrasi kedua menjadi mg CO
2
dengan menggunakan mol ekivalen HCl = mol ekivalen CO
2.
Jadi 1 ml 0,1 N HCl = 4,4 mg CO
2
. Diagram alir pengukuran kadar CO
2
dapat dilihat pada Lampiran 5. Reaksi yang terjadi dalam titrasi sampel dan blanko
adalah sebagai berikut: 1
. Perubahan warna dari merah muda menjadi tidak berwarna indikator PP Na
2
CO
3
+ HCl NaCl + NaHCO
3
2 . Perubahan warna dari kuning menjadi merah muda indikator Metil Jingga
NaHCO
3
+ HCl NaCl + H
2
O + CO
2
Jumlah CO
2
yang dihasilkan dalam biometer dibandingkan dengan blanko, kemudian dilakukan penggantian labu setiap 2 hari sekali selama 50 hari atau
sampai perbedaan CO
2
yang didapatkan pada labu uji dan labu blanko menjadi nol. Pengujian dilakukan sebanyak dua kali ulangan. Pengujian ini akan
menghasilkan kurva hubungan antara produksi CO
2
dan waktu serta perbandingan laju biodegradasi bioplastik dengan pemlastis yang berbeda Andrady, 2000.
Selain penghitungan atau pengukuran CO
2
, dilakukan penghitungan persen kehilangan bobot yang menunjukkan terjadinya proses biodegradasi. Rumus
penghitungan persentase kehilangan bobot adalah sebagai berikut: Persentase Kehilangan Bobot = Bobot awal gr - Bobot Akhir gr x 100
Bobot Awal Penghitungan laju produksi CO
2
yang dilakukan adalah penghitungan laju produksi CO
2
harian dan laju produksi CO
2
akumulasi harian. Penghitungan laju
produksi CO
2
harian dilakukan dengan cara membagi produksi CO
2
per 2 hari. Rumus penghitungan laju produksi CO
2
harian adalah sebagai berikut: Laju Produksi CO
2
Harian = Produksi CO
2
tiap analisa 2
Sedangkan Rumus penghitungan laju produksi CO
2
akumulasi harian adalah sebagai berikut:
Laju Produksi CO
2
Harian = Produksi CO
2
akumulasi harian Akumulasi hari
C. Waktu dan Tempat Penelitian
Kategori