14
Evaluasi imunohistokimia terhadap antigen virus hog cholera di lakukan dengan memberi skor berdasarkan jumlah sel positif per lapangan pandang yang di
lakukan dengan menghitung jumlah sel positif pada perbesaran 40 kali di 10 lapangan pandang. Sebagai gambaran skor + berarti terdapat 0-50 sel positif, skor ++ berarti
terdapat 50-100 sel positif, skor +++ berarti terdapat lebih dari 100 sel positif Skoring perubahan histopatologi buluh darah arteri organ paru-paru, jantung,
hati, ginjal dan limpa di lakukan dengan memberi skor di 10 lapangan pandang, menggunakan pembesaran 40 kali. Penentuan skor untuk semua buluh darah di lakukan
dengan cara yang sama. Nilai skor yang di amati dapat di lihat pada tabel 2 di bawah ini.
Tabel 2. Nilai Skor Lesio Histopatologi Buluh Darah
Skor Deskripsi
0 Tidak ada
perubahan 1
Terjadi hipertrofi endotel 2
Terjadi deskuamasi endotel, perubahan degenerasi vakuolar tunika media dan adventisia
3 Terjadi hialinisasi tunika media, perubahan
degenerasi vakuolar dan nekrosa pada tunika media dan adventisia, trombus, vaskulitis.
Analisis data lesio histopatologi organ dan lesio buluh darah arteri menggunakan metode statistik non parametrik U Man-Whitney Aviva et al. 2006
untuk membedakan 2 sampel independen antara babi sakit dan babi sehat sebagai kontrol sedangkan data distribusi antigen di olah secara deskriptif dan di buat dalam
histogram.
3.3.1 Pembuatan Sediaan Histologi
Seluruh organ yang di sampling di fiksasi di dalam buffer netral formalin BNF 10, minimal selama 48 jam. Selanjutnya sampel di proses untuk membuat
sedíaan histopatologi, melalui tahapan dehidrasi di dalam larutan alkohol konsentrasi
bertingkat 70 hingga 100, clearing di dalam larutan xilol dengan ulangan
15
sebanyak tiga kali. Proses berikutnya adalah infiltrasi parafin cair ke dalam jaringan. Proses pembuatan di lakukan dengan alat automatic tissue processor Sakura™.
Pembuatan blok jaringan di lakukan dalam parafin pada tissue embedding console Sakura™. Blok jaringan di iris menggunakan mikrotom dengan ketebalan 3-5 µm.
Hasil sayatan di lekatkan diatas gelas objek dan di inkubasi dalam inkubator dengan suhu 37
o
C selama 1 malam dan siap di warnai. Untuk pewarnaan imunohistokimia
IHK, gelas objek terlebih dahulu di lapisi dengan gelatin 6 .
3.3.2. Pewarnaan Hematoxyllin-Eosin, Masson Trichrome, Verhoeff Van Giesson
dan Imunohistokimia
Pewarnaan Hematoxyllin Eosin HE di lakukan untuk mengamati perubahan jaringan secara umum, Masson Trichrome MT dan Verhoeff Van Giesson VVG di
gunakan untuk mengamati perubahan struktur buluh darah. Hasil pewarnaan diinterpretasikan sebagai berikut: warna merah kekuningan atau kecoklatan pada
Masson Trichrome MT menunjukkan struktur kolagen, sedangkan warna biru
menunjukan struktur serabut elastik. Warna biru hitam pada Verhoeff Van Giesson
VVG menunjukkan serabut elastik. Pewarnaan imunohistokimia di lakukan untuk mengetahui distribusi antigen hog cholera pada organ-organ sampel.
Sebelum pewarnaan, sayatan jaringan pada objek gelas di lakukan deparafinisasi dan rehidrasi lampiran 1. Selanjutnya di warnai dengan HE metode
Humason 1972 yang di modifikasi, Verhoeff Van Giesson dan Masson Trichrome
modifikasi Goldner Kiernan 1990. Pewarnaan imunohistokimia di lakukan berdasarkan metoda Avidin Biotin Complex ABC method Hsu et al. 1981. Sebelum
di lakukan proses pewarnaan, terlebih dahulu di lakukan proses preinkubasi terhadap jaringan, yang meliputi blocking endogenous peroxidase dengan larutan 0,3 H
2
O
2
dalam metanol selama 30 menit untuk memblokir aktivitas peroksida endogen dan blocking background
dengan 10 normal goat serum selama 30 menit Vector Laboratories, Inc. Untuk un masking antigen di lakukan dengan cara pemanasan
menggunakan microwave 100
o
C selama 5 menit. Selanjutnya di inkubasi menggunakan antibodi primer yaitu anti-HCV antibody monoclonal WA303, Central Veterinary
Laboratory, New Haw, Addlestone, UK dengan pengenceran 1:500, diinkubasi di
dalam refrigerator selama 24 jam. Antibodi sekunder, di gunakan Histofine code 424021
Nichirei Corp. selama 30 menit dalam inkubator 37
o
C. Sebagai marker di gunakan campuran 10
μl avidin dan 10 μl biotin Vector Laboratories, Inc. dalam 1 ml
16
PBS dan di inkubasi dalam inkubator dengan suhu 37
o
C selama 30 menit
. Untuk
visualisasi hasil pewarnaan, jaringan di inkubasi dengan larutan 0.03 3.3- diaminobenzidine tetrahydrochloride DAB
selama 5-10 menit. Pada setiap langkah di atas, jaringan di bilas menggunakan larutan Phosphat buffer saline PBS. Untuk
pewarnaan latar belakang di gunakan pewarna Mayer Hematoxyllin
selama 30 detik. Selanjutnya sampel di dehidrasi dan clearing, kemudian di tutup dengan gelas penutup
menggunakan bahan perekat entelan.
17
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Gejala Klinis
