Pengumpulan Sampel dari Pasaran Pembuatan Lembaran Cangkang Kapsul Keras Simulasi dari

698 1243 1338 1409 1455 1556 1633 3263 GB 1 1,12 0,36 0,32 0,34 0,39 0,65 0,96 1,09 GB 2 1,14 0,36 0,32 0,33 0,39 0,65 0,96 1,06 GS 1 1,22 0,41 0,36 0,39 0,45 0,73 0,99 1,13 GS 2 1,20 0,44 0,38 0,41 0,48 0,80 1,07 1,11 KGS 1 1,37 0,40 0,39 0,40 0,45 0,69 1,13 1,37 KGS 2 1,37 0,30 0,37 0,38 0,44 0,66 1,10 1,37 KGB 1 1,22 0,26 0,26 0,26 0,32 0,51 0,89 1,20 KGB 2 1,22 0,32 0,30 0,32 0,37 0,60 0,95 1,23 Kapsul A1 1,14 0,30 0,28 0,30 0,32 0,52 0,81 1,05 KapsulA2 1,13 0,26 0,25 0,27 0,28 0,45 0,77 1,09 Kapsul B1 1,27 0,44 0,44 0,45 0,46 0,61 0,91 1,23 Kapsul B2 1,28 0,45 0,44 0,46 0,48 0,66 0,94 1,23 Kapsul C1 1,31 0,32 0,37 0,34 0,35 0,51 0,90 1,25 Kapsul C2 1,30 0,33 0,37 0,35 0,36 0,52 0,90 1,25 Kapsul D1 1,20 0,33 0,31 0,33 0,37 0,62 0,94 1,12 Kapsul D2 1,21 0,34 0,31 0,33 0,37 0,62 0,93 1,13 Kapsul E1 1,31 0,36 0,34 0,36 0,39 0,62 1,01 1,31 Kapsul E2 1,31 0,37 0,34 0,36 0,40 0,63 1,00 1,31 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Berdasarkan kontribusi PC1 dan PC2 maka dapat dibuat kurva score plot. Kurva score plot digunakan untuk menaksir struktur data yaitu sebagai dasar perbedaan gelatin sapi dan babi Minitab 15 Statguide, 2007. Semakin dekat letak antar sampel pada score plot, maka semakin besar pula kemiripannya atau sampel merupakan kelompok yang sama. Sampel dengan nilai score plot yang hampir sama mempunyai sifat fisika kimia yang hampir sama. Pada software Minitab 15, pengelompokan dilakukan berdasarkan posisi sampel pada score plot, apakah memiliki nilai PC1 dan PC2 yang positif ataukah negatif. Pada gambar 17 merupakan kurva score plot PC1 dan PC2 pada standar gelatin, lembaran kapsul keras dan sampel uji. Keterangan: GB : standar gelatin babi, GS : standar gelatin sapi, KGB : kapsul gelatin babi, KGS : kapsul gelatin sapi, A: sampel 1, B: sampel 2, C: sampel 3, D: sampel 4, E: sampel 5 Gambar 17 . Kurva score plot FTIR PC1 dan PC2 pada standar gelatin, lembar cangkang kapsul Keras Simulasi dan produk cangkang kapsul keras dari pasaran Berdasarkan hasil kurva score plot diatas tampak bahwa lembar cangkang kapsul yang dibuat dari gelatin babi berada pada kuadran 3 yang memiliki nilai PC1 dan PC2 negatif. Lembar cangkang kapsul keras yang dibuat dari gelatin babi tersebut dapat dibedakan dari kapsul yang dibuat dari 4 3 2 1 -1 -2 -3 -4 -5 2 1 -1 -2 -3 First Component S e c o n d C o m p o n e n t Score Plot of 702, ..., 3263 KGB KGB C C E E KGS KGS B B GS GS D D A A GB GB I Ii Iv Iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta gelatin sapi yang berada pada kuadran 4 yang memiliki nilai PC1 positif dan PC2 negatif. Sementara itu standar gelatin babi berada pada kuadran 2 yang memiliki nilai PC1 negatif dan PC2 positif dan standar gelatin sapi berada pada kuadran 1 yang memiliki nilai PC1 dan PC2 positif. Hal ini dapat disimpulkan bahwa standar gelatin babi dan standar gelatin sapi memiliki profil asam amino yang berbeda dengan lembar cangkang kapsul simulasi yang dibuat dari gelatin yang sama. Hal ini dapat disebabkan karena pada saat formulasi dilakukan pemanasan, penambahan bahan-bahan tambahan atau proses ekstraksi yang kurang baik yang dapat mempengaruhi komposisi asam amino. Pada sampel uji A dan D berada pada kuadran yang sama dengan standar gelatin babi yaitu pada kuadran 2. Begitu juga dengan sampel uji C berada pada kuadran yang sama dengan lembar cangkang kapsul yang dibuat dari standar gelatin babi. Hal ini diduga bahwa sampel uji A, C dan D memiliki kemiripan sifat fisika kimia yang sama dengan standar gelatin babi. Pada sampel uji B berada pada kuadran yang sama dengan standar gelatin sapi yaitu berada pada kuadran 1 sedangkan sampel uji E berada pada kuadran yang sama dengan lembar cangkang kapsul yang dibuat dari gelatin sapi. Hal ini diduga bahwa sampel uji B dan E memiliki kemiripan sifat fisika kimia yang sama. Untuk mengetahui variabel asam amino yang paling berpengaruh terhadap pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi dapat dilihat berdasarkan kurva loading plot yang dihasilkan dari analisis PCA. Kurva loading plot digunakan untuk menentukan variabel asam amino yang paling berkontribusi dalam pembentukan nilai principal component. Semakin jauh suatu variabel dari titik asalnya 0,0 maka kontribusinya terhadap proses PCA akan semakin besar Widyaninggar et al., 2011. Gambar 18 adalah kurva yang menunjukkan loading plot untuk PC1 dan PC2. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6 First Component S e c o n d C o m p o n e n t 3263 1633 1556 1455 1409 1338 1243 698 Loading Plot of 698, ..., 3263 Gambar 18 . Kurva loading plot FTIR PC1 dan PC2 pada standar gelatin, lembar cangkang kapsul keras simulasi dan produk cangkang kapsul keras dari pasaran. Dari kurva loading plot diatas diketahui bahwa bilangan gelombang 1455 cm -1 , 1409 cm -1 dan 1338 cm -1 memiliki jarak horisontal terjauh dari garis x = 0. Artinya variabel tersebut memiliki kontribusi paling besar terhadap pembentukan nilai PC1 dengan nilai koefisien masing-masing 0,420, 0,408, dan 0,392. Sedangkan variabel – variabel yang berkontribusi paling besar terhadap pembentukan PC2 memiliki jarak terjauh vertikal dari garis y = 0 adalah bilangan gelombang 1556 cm -1 , 698 cm -1 dan 3263 cm -1 dengan nilai koefisien masing-masing 0,341, 0,276, 0,235. Variabel-variabel lain dengan nilai koefisien yang lebih kecil juga tetap berpengaruh pada nilai PC1 dan PC2 yang akhirnya juga berpengaruh pada score plot dan menentukan hasil pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi. Walaupun demikian kontribusinya tidak sebesar variabel-variabel utama diatas. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.4 Analisis Gelatin dengan KCKT

4.4.1 Hidrolisis Asam Amino

Hidrolisis asam amino dilakukan dengan menimbang 0,1 gram kapsul gelatin keras dengan menambahkan larutan HCl 6 N sebanyak 5 ml dengan konsentrasi 2. Proses hidrolisis dilakukan pada suhu 110 o C selama 22 jam di dalam oven. Hidrolisis dilakukan menggunakan HCl karena HCl bersifat oksidator kuat yang dapat memecah ikatan peptida secara sempurna. Setelah dihidrolisis, campuran didinginkan pada suhu ruang. Pada hidrolisis asam, asparagin dan glutamin dihidrolisis menjadi asam aspartat dan asam glutamat, triptofan secara lengkap dirusak, sistein tidak dapat ditentukan, tirosin sebagian dirusak, serin dan treonin dapat dihidrolisis tetapi masih rusak sekitar 10 dan 5 berturut-turut Fountoulakis, M., Lahm, H.W, 1998. Kemudian isi tabung tersebut dipindahkan ke dalam labu ukur 50 ml dan ditambahkan aquabidest sampai tanda batas sehingga konsentrasi larutan menjadi 0,2. Hasil hidrolisis menghasilkan larutan hitam kecoklatan, sehingga di filter terlebih dahulu dengan menggunakan membran filter berpori 0,45 µm. Hal ini bertujuan untuk memisahkan asam amino dari komponen lain yang dapat mengganggu proses pada saat analisis. Setelah proses filtrasi menggunakan membran filter 0,45 µm, larutan akan terlihat bening dan bersih. Hidrolisis dilakukan untuk melepaskan asam amino - asam amino yang terdapat dalam gelatin, yaitu melalui pemotongan ikatan peptida asam amino penyusun gelatin. Selama proses hidrolisis ini, hubungan antara ikatan rantai polipeptida dari kolagen dengan ikatan rantai polipeptida yang lain akan menjadi terpisah. Hal ini disebabkan karena rusaknya struktur fibrosa dari kolagen See et al., 2010. Setelah itu dipipet sebanyak 500µL, ditambahkan 40µL larutan standar internal 6,45mg α-aminobutyric acid dalam 25 mL HCl 0,1M ditambahkan 460 µL aquabides sehingga konsentrasi larutan menjadi 0,1. Penambahan larutan standar internal digunakan sebagai faktor koreksi kesalahan volumetrik selama persiapan sampel dan mengkoreksi hilangnya residu asam amino selama proses hidrolisis yang akan dideteksi dengan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta berkurangnya standar internal, sehingga penggunaan larutan standar internal dapat meningkatkan presisi.

4.4.2 Derivatisasi Asam Amino

Derivatisasi asam amino dilakukan dengan menambahkan 70 µL AccQ.Tag Fluor borate dan 20 µL reagen fluor A ke dalam 10 µl filtrat dengan konsentrasi 0,01. Kemudian di vortex dan diamkan selama 1 menit. Inkubasi selama 10 menit pada suhu 55 C, lalu disuntikkan 5 µL filtrat ke dalam HPLC. Proses ini merupakan proses derivatisasi pra kolom. Asam amino akan diderivatisasi terlebih dahulu di dalam hidrolisat, kemudian derivat dipisahkan pada HPLC fase terbalik. Kelebihan dari derivatisasi pra kolom yaitu waktu analisa cepat, dan cocok untuk analisa dengan jumlah residu yang sedikit atau sekitar 20 residu Fountoulakis, M., Lahm, H.W, 1998. Kolom yang digunakan Waters AccQtaq 3,9 x 150 mm dengan temperatur kolom 37°C, laju alir fase gerak 1,0 mLmenit, kromatografi menggunakan sistem gradien dengan fase gerak AccQTag Eluent A buffer asetat-fosfat dan Acetonitril 60 grade HPLC campuran 60 asetonitril dan 40 aquabidest. Detektor yang digunakan adalah detektor fluoresen. Detektor fluoresen memonitor emisi dari cahaya fluoresen dari fase gerak. Detektor fluoresen lebih selektif dan sangat sensitif pikogram sampai femtogram untuk komponen dengan daya fluoresen tinggi Ahuja, S., Dong, M.W, 2005. Detektor fluoresen yang digunakan adalah detektor fluoresen 2475 dengan panjang gelombang emisi 395 nm dan panjang gelombang eksitasi 250 nm. Hal ini dapat diartikan bahwa detektor memancarkan gelombang pada panjang gelombang 250 nm dan menangkap emisi fluoresensi yang dipancarkan oleh sampel pada panjang gelombang 395 nm. Ada beberapa agen penderivat yang dapat digunakan untuk menderivatisasi asam amino antara lain ortho-phtalaldehyde OPA, 7-kloro-4-nitrobenzo2-oksa-1,3- diazol NBD-Cl, 3-mercaptopropionic acid MPA, aminokuinolil -N- hidroksisuksini-midil karbamat AQC. Metode derivatisasi yang digunakan adalah metode AccQTaq yang menggunakan reagen aminokuinolil -N- UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.5.2 Analisis Asam Amino pada Standar Gelatin, Lembar Cangkang

Kapsul Keras Simulasi dan Produk Cangkang Kapsul Keras dari Pasaran. Tabel 4.5 Komposisi Asam Amino pada Standar Gelatin dan Lembar Cangkang Kapsul keras dalam bb 1 gram100 gram Berdasarkan tabel di atas menunjukkan bahwa asam amino glisin, prolin dan arginin pada gelatin babi memiliki kadar yang lebih tinggi dibandingkan dengan gelatin sapi. Gelatin memiliki kadar asam amino metionin, sistin dan tirosin yang rendah. Semua jenis asam amino terdapat dalam gelatin kecuali triptofan Nhari et al., 2011. Pada penelitian ini juga dihasilkan asam amino glisin, prolin dan arginin pada gelatin babi memiliki Asam Amino Standar gelatin babi 210,2200 Standar gelatin sapi 210,2199 Lembaran Kapsul keras dari standar gelatin babi 209,2244 Lembaran Kapsul keras dari standar gelatin sapi 209,2245 L-Aspartic acid 5,258 4,471 1,293 1,331 L-Serine 3,213 3,017 1,128 1,181 L-Glutamic acid 8,219 7,344 2,531 2,490 Glycine 21,944 20,493 7,442 7,936 L-Histidine 1,642 1,552 0,409 0,481 L-Arginine 11,448 9,319 2,940 3,109 L-Threonine 2,360 1,934 0,635 0,737 L-Alanine 6,659 6,187 2,980 2,491 L-Proline 10,274 9,542 1,008 1,563 L-Cystine 0,461 0,201 0,000 0,000 L-Tyrosine 0,925 0,474 0,398 0,546 L-Valine 2,635 2,361 0,722 0,715 L- Metheonine 0,648 0,856 0,461 0,622 L-Lysin HCl 2,771 2,647 0,892 0,829 L-Isoleucine 1,347 1,616 0,362 0,454 L-Leucine 2,900 2,879 0,904 0,872 L- Phenylalanine 3,229 2,276 0,729 0,831 Triptophan 0,000 0,000 0,000 0,000 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta kadar yang lebih tinggi dibandingkan dengan gelatin sapi dan memiliki kadar asam amino metionin dan tirosin yang rendah sedangkan asam amino triptofan rusak selama proses hidrolisis. Selanjutnya dilakukan penetapan kadar masing-masing asam amino pada standar gelatin, lembaran cangkang kapsul keras simulasi dan sampel uji cangkang kapsul keras. Untuk mengetahui kadar masing-masing asam amino pada gelatin, dapat dilakukan pehitungan sebagai berikut : Contoh: Asam amino asam L-aspartic mg100gram pada sampel uji cangkang kapsul B = µ , µ , x 100 = 4571,9 mg100gram bb

4.6 Analisis PCA Principal Components Analysis pada Standar Gelatin,

Lembar Cangkang Kapsul Keras Simulasi dan Produk Cangkang Kapsul Keras dari Pasaran. Pengelompokkan masing-masing sampel gelatin dapat dilakukan dengan menggunakan teknik kemometrik yaitu PCA Principal Components Analysis. Pada puncak kromatogram PCA dapat mengekstrak komponen utama dan mengklasifikasikan gelatin sapi dan babi Nemati et al., 2004. Dalam penelitian ini variabel yang digunakan adalah tinggi puncak dari masing masing asam amino dalam kromatogram. Variabel tinggi puncak dipilih karena tinggi puncak berbanding lurus dengan konsentrasi asam amino pada sampel. Jumlah variabel yang digunakan 15 variabel tinggi puncak 15 asam amino. Setelah itu data tinggi puncak masing-masing asam amino pada kromatogram hasil analisis standar gelatin babi dan sapi, lembaran cangkang kapsul keras simulasi dan sampel uji dimasukkan ke dalam software minitab 15. Kemudian dilakukan analisis PCA. = x 100 Tabel 4.6 Work kapsul pasar Tabel 4.7 Kontri UIN Syarif Hiday orksheet pada penyusunan standar gelatin, le psul keras simulasi dan produk cangkang ka saran dengan PCA ontribusi masing-masing variabel terhadap nilai kom ayatullah Jakarta , lembar cangkang kapsul keras dari i komponen utama UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Berdasarkan kontribusi PC1 dan PC2 maka dapat dibuat kurva score plot. Kurva score plot digunakan untuk menaksir struktur data yaitu sebagai dasar perbedaan gelatin sapi dan babi Minitab 15 Statguide, 2007. Semakin dekat letak antar sampel pada score plot, maka semakin besar pula kemiripannya atau sampel merupakan kelompok yang sama. Sampel dengan nilai score plot yang hampir sama mempunyai sifat fisika kimia yang hampir sama. Pada Minitab, pengelompokan dilakukan berdasarkan posisi sampel pada score plot, apakah memiliki nilai PC1 dan PC2 yang positif ataukah negatif. gelatin, lembaran cangkang kapsul keras simulasi dan sampel uji. Pada gambar 21 dapat dilihat kurva score plot PC1 dan PC2 penyusun standar gelatin, lembaran kapsul simulasi dan sampel uji. Keterangan: GB : standar gelatin babi, GS : standar gelatin sapi, KB : lembaran kapsul keras gelatin babi, KS : lembaran kapsul keras gelatin sapi, A: sampel 1, B: sampel 2, C: sampel 3, D : sampel 4, E: sampel 5 Gambar 21 . Kurva score plot HPLC PC1 dan PC2 pada standar gelatin dan lembaran kapsul Keras Simulasi dan sampel uji Berdasarkan kurva score plot diatas bahwa standar gelatin babi dan lembar cangkang kapsul yang dibuat dari standar gelatin babi berada dalam satu kuadran yaitu kuadran 2 yang memiliki nilai PC1 negatif dan PC2 positif. Standar gelatin sapi dan lembar cangkang kapsul yang dibuat dari standar 4 3 2 1 -1 -2 -3 -4 -5 3 2 1 -1 -2 -3 First Component S e c o n d C o m p o n e n t Score Plot of aspartat, ..., penilalanin KS GS GS GB GB KB KB E E C C A A D D B B KS I Ii Iii i Iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta gelatin sapi berada dalam satu kuadran yaitu kuadran 3 yang memiliki nilai PC1 dan PC2 negatif. Hal ini menunjukkan bahwa standar gelatin babi dengan lembar cangkang kapsul simulasi babi dan standar gelatin sapi dengan lembar cangkang kapsul simulasi sapi memiliki komposisi asam amino yang sama dan dapat dipisahkan dengan proses ekstraksi yang baik oleh sistem HPLC. Sementara itu kurva score plot pada sampel uji A,B,C dan D memiliki nilai PC1 dan PC2 positif. Sedangkan sampel uji E memiliki nilai PC1 positif dan PC2 negatif. Hal ini diduga bahwa sampel A,B,C,D dan E terbuat dari campuran antara gelatin babi dan sapi atau terbuat dari selain gelatin sapi atau gelatin babi. Untuk mengetahui variabel asam amino yang paling berpengaruh terhadap pembeda gelatin sapi dan gelatin babi dapat dilihat dari kurva loading plot yang dihasilkan dari analisis PCA. Loading plot ini digunakan untuk menentukan variabel asam amino yang paling berkontribusi dalam pembentukan nilai principal component. Semakin jauh suatu variabel dari titik asalnya 0,0 maka kontribusinya terhadap proses PCA akan semakin besar Widyaninggar et al., 2011. Gambar 22 adalah kurva yang menunjukkan loading plot untuk PC1 dan PC2. Gambar 22. Kurva loading plot PC1 dan PC2 pada standar gelatin, lembar cangkang kapsul keras simulasi dan produk cangkang kapsul keras dari pasaran 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 First Component S e c o n d C o m p o n e n t penilalanin leucin isoleusin ly sin hcl metionin v aline ty rosine prolin alanin threonin arginin gly cine glutamat serine aspartat Loading Plot of aspartat, ..., penilalanin UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Berdasarkan kurva loading plot diatas bahwa variabel tirosin, treonin dan leusin memiliki jarak horizontal yang jauh dari garis x = 0, artinya asam amino tersebut memiliki kontribusi yang besar pada pembentukan nilai PC1 dengan nilai koefisien masing-masing -0.321, 0.102 dan 0.305. Sedangkan variabel – variabel yang berkontribusi paling besar terhadap pembentukan PC2 memiliki jarak terjauh vertikal dari garis y = 0 adalah lysine hcl, valin dan glisin dengan nilai koefisien masing-masing -0.341, 0.317 dan 0.341. Variabel variabel lain dengan nilai koefisien yang lebih kecil juga tetap berpengaruh pada nilai PC1 dan PC2 yang akhirnya juga berpengaruh pada score plot dan menentukan hasil pembeda gelatin sapi dan gelatin babi. Walaupun demikian kontribusinya tidak sebesar variabel-variabel utama diatas. 54 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Analisis perbedaan gelatin babi dan gelatin sapi dengan metode FTIR dan teknik kemometrik PCA Principal Component Analysis dapat mengklasifikasikan kedua sumber gelatin. 2. Analisis perbedaan gelatin babi dan gelatin sapi dengan metode HPLC dengan teknik kemometrik PCA Principal Component Analysis baru bisa membedakan komposisi asam amino pada standar gelatin sapi dan babi serta lembaran kapsul keras yang dibuat sendiri, tetapi belum bisa membedakan sumber gelatin yang dipakai pada produk kapsul keras yang diambil dari pasaran.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan pengujian lebih lanjut yaitu dengan optimasi preparasi sampel pada metode FTIR karena bisa jadi masih terdapat pengotor yang ikut terbawa dalam sampel gelatin. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap cara membedakan gelatin babi dan gelatin sapi pada produk kapsul keras yang diperoleh dari pasaran dengan metode HPLC dengan teknik PCA serta perlu dilakukan variasi lebih banyak yaitu dengan membuat lembaran cangkang kapsul keras yang dibuat dengan menggunakan campuran gelatin babi dan sapi dengan berbagai konsentrasi.