24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium PMC
Pharmacy Medicinal Chemistry , Laboratorium
Pharmacy Drugs Development and Reseach
PDR FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli 2012 sampai dengan bulan November 2012.
3.2. Sampel 3.2.1. Sampel Bahan Uji
Sampel bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1.
Daun durian Durio zibethinus L sebanyak 2 kg, diperoleh dari kebun halaman depan Asrama Putra Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta, diambil pada tanggal 18 April 2012 jam 08.00 WIB. 2.
Daun rambutan Nephelium lappaceum L sebanyak 2 kg, diperoleh dari kebun depan Kampus Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas
Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta, diambil pada tanggal 12 April 2012 jam 08.00 WIB.,
3. Daun lengkeng Dimocarpus longan Lour sebanyak 2 kg, diperoleh dari
halaman depan Sekolah Pascasarjana Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta, diambil pada tanggal 14 April 2012 jam 08.00 WIB.
3.2.2. Determinasi Tanaman
Sampel tanaman daun durian Durio zibethinus L, daun rambutan Nephelium lappaceum L dan daun lengkeng Dimocarpus longan Lour di
identifikasi di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Puslit biologi, LIPI Cibinong lampiran 1.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3. Alat, BahanReagen dan Bakteri Uji 3.3.1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain perangkat destilasi, perangkat alat vacum rotary evaporator
Eyela N-1000 , erlenmeyer
Pyrex, timbangan analitik, blender Philips, desikator, hot plate Advanted, spatula, batang pengaduk, gelas ukur Pyrex, pinset, alumunium foil, kapas
steril, kertas saring, pipet tetes, vial, spot plate, cawan petri, incubator Memmert, lemari pendingin Sanyo, blue tips, Laminar Air Flow Shinnihon
Kagaku, autoklaf, ose, bunsen, mikropipet Nichipet ex, oven Memmert, tabung reaksi Pyrex, rak tabung reaksi, corong pisah Pyrex, vortex Labnet
International Inc, penangas Torrey pines scientific, gunting, lampu spritus, kertas saring Whatman no.52.
3.3.2. Bahan Kimia
Bahan-bahan kimia yang digunakan diantaranya: Mueller Hinton Agar MHA, Nutrient Agar, NaCl , FeCl
3
, etanol 70, serbuklempeng magnesium, HCl pekat , pereaksi Draggendorff, pereaksi Meyer, kloroform,
natrium sulfat anhidrat, asam asetat anhidrat, H
2
SO
4
pekat, aquadest.
3.3.3. Bakteri Uji dan Antibakteri Pembanding
Bakteri yang digunakan adalah Staphylococcus aureus ATCC 25925 bakteri Gram positif dan Escherichia coli ATCC 25922 bakteri Gram
negatif yang didapat dari Laboraturium Mikrobiologi dan Parasitologi FKIK
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Antibakteri pembanding yang digunakan adalah amoksisilin
25 μg
yang diperoleh dari Bagian Baku Pembanding, Badan POM RI, Jakarta.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4. Prosedur Kerja 3.4.1. Pembuatan Ekstrak
3.4.1.1. Penyiapan Bahan dan Alat 3.4.1.1.1. Daun Durian
Daun durian Durio zibethinus L segar ditimbang sebanyak 2 kg, dicuci bersih dengan air mengalir, lalu dikeringkan dengan cara diangin-
anginkan pada suhu ruang dan terhindar dari sinar matahari langsung. Diperoleh simplisia kering, kemudian simplisia kering tersebut digiling
menggunakan blender sehingga diperoleh serbuk simplisia daun durian
sebanyak 212 gram. 3.4.1.1.2. Daun Rambutan
Daun rambutan Nephelium lappaceum L segar ditimbang sebanyak 2 kg, dicuci bersih dengan air mengalir, lalu dikeringkan dengan cara
diangin-anginkan pada suhu ruang dan terhindar dari sinar matahari langsung. Diperoleh simplisia kering, kemudian simplisia kering tersebut
digiling menggunakan blender sehingga diperoleh serbuk simplisia daun rambutan sebanyak 202 gram.
3.4.1.1.3. Daun Lengkeng
Daun lengkeng Dimocarpus longan Lour segar ditimbang sebanyak 2 kg,
dicuci bersih dengan air mengalir, lalu dikeringkan dengan cara
diangin-anginkan pada suhu ruang dan terhindar dari sinar matahari langsung. Diperoleh simplisia kering, kemudian simplisia kering tersebut
digiling menggunakan blender sehingga diperoleh serbuk simplisia daun lengkeng sebanyak 175 gram.
3.4.2. Ekstraksi dengan Pelarut Organik 3.4.2.1.
Ekstraksi Daun Durian
Serbuk daun durian Durio zibethinus L ditimbang
sebanyak 212 gram, dimaserasi dengan menggunakan etanol 70 sebanyak 3000 mL
selama 21 hari dengan sesekali di aduk, pelarut diganti setiap 7 hari.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Kemudian disaring dengan menggunakan kapas dan kertas saring, Filtrat dipisahkan dari pelarutnya pada suhu 70
C dengan menggunakan vacuum rotary evaporator, sehingga diperoleh ekstrak kental
daun durian Durio
zibethinus L sebanyak 12,45 g. 3.4.2.2.
Ektraksi Daun Rambutan
Daun rambutan Nephelium lappaceum L ditimbang sebanyak 202
gram, dimaserasi dengan menggunakan etanol 70 sebanyak 3000 mL
selama 21 hari dengan sesekali di aduk, pelarut diganti setiap 7 hari. Kemudian disaring dengan menggunakan kapas dan kertas saring, Filtrat
dipisahkan dari pelarutnya pada suhu 70 C dengan menggunakan vacuum
rotary evaporator, sehingga diperoleh ekstrak kental daun rambutan
Nephelium lappaceum L sebanyak 44,73 g.
3.4.2.3. Ektraksi Daun Lengkeng
Daun lengkeng Dimocarpus longan Lour ditimbang sebanyak 175 gram,
dimaserasi dengan menggunakan etanol 70 sebanyak 2100 mL selama 21 hari dengan sesekali di aduk, pelarut diganti setiap 7 hari.
Kemudian disaring dengan menggunakan kapas dan kertas saring, Filtrat dipisahkan dari pelarutnya pada suhu 70
C dengan menggunakan vacuum rotary evaporator, sehingga diperoleh ekstrak kental
daun lengkeng Dimocarpus longan Lour sebanyak 20,07 g.
3.4.3. Pemeriksaan Karakteristik Ekstrak Depkes RI, 2000
Pemeriksaan karakteristik ekstrak daun durian, daun rambutan dan daun lengkeng dengan cara :
a. Organoleptik
Pengujian ini dilakukan dengan mengamati bentuk, warna dari ekstrak yang dihasilkan.
b. Rendemen ekstrak
Rendemen ekstrak etanol daun durian Durio zibethinus L, daun rambutan
Nephelium lappaceum L dan daun lengkeng Dimocarpus longan Lour
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dihitung dengan membandingkan bobot awal simplisia dengan bobot akhir ekstrak yang dihasilkan.
c. Susut pengeringan Materia Medika Indonesia V. 1989
Pemeriksaan ini dilakukan dengan cara menimbang ekstrak sebanyak ±10 g dan dimasukkan kedalam botol timbang bertutup yang sebelumnya telah
ditara. Kemudian dimasukkan kedalam oven pada suhu 105 C sehingga
diperoleh bobot yang relatif tetap. Lanjutkan pengeringan dan timbang pada jarak 1 jam sampai perbedaan antara dua penimbang berturut - turut
tidak lebih dari 0,25.
Keterangan : a = bobot cawan kosong
b = bobot sampel dan cawan sebelum dikeringkan dalam oven c = bobot sampel dan cawan setelah dikeringkan dalam oven
3.4.4. Penapisan Fitokimia Ayoola et al., 2008.
Pemerikasaan kandungan kimia dalam daun durian Durio zibethinus
L, daun rambutan Nephelium lappaceum L dan daun lengkeng Dimocarpus longan Lour
diantaranya: a.
Identifikasi senyawa saponin 0,5 g ekstrak ditambahkan 5 mL air suling di tabung percobaan. Larutan
dikocok secara perlahan dan diamati hingga terbentuk busa yang stabil. b.
Identifikasi golongan flavonoid Sejumlah tertentu serbukekstrak sampel tumbuhan ditambahkan 100 mL
aquadest panas, dididihkan selama 15 menit, saring dengan kertas saring, diperoleh filtrat yang akan digunakan sebagai larutan percobaan. Kedalam 5
mL larutan percobaan dalam tabung reaksi, ditambahkan serbuk atau
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
lempeng magnesium secukupnya dan 1 mL HCl pekat, tambahkan 5 mL amilalkohol, dikocok dengan kuat, biarkan hingga memisah, terbentuk
warna merah, kuning dan jingga pada lapisan amilalkohol menunjukan adanya senyawa flavonoid Harbone, 1984.
c. Identifikasi golongan hidrokuinon
Sejumlah ekstrak sampel ditaruh pada spot plate dan ditambahkan NaOH 10. Terbentuknya warna merah menandakan uji positif adanya senyawa
fenol hidrokuinon Harbone, 1984. d.
Identifikasi golongan tannin fenol 0,5 g ekstrak dipanaskan dalam 10 mL air dalam tabung reaksi kemudian
disaring. Beberapa tetes ferri klorida 0,1 ditambahkan dan diamati pembentukan untuk warna hijau kecoklatan atau pewarnaan biru kehitaman.
e. Identifikasi golongan alkaloid
Sejumlah tertentu ekstrak sampel tumbuhan dilembabkan dengan 5 mL ammonia 30, digerus dalam mortir, lalu tambahkan 20 mL kloroform dan
digerus kembali dengan kuat, campuran tersebut disaring dengan kertas saring, filtrat berupa larutan organik di ambil sebagai larutan A, sebagian
dari larutan A 10 mL diekstraksi dengan 10 mL larutan HCl 1:10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, ambil larutan bagian atasnya larutan B.
larutan A diteteskan beberapa tetes pada kertas saring dan disemprot atau ditetesi dengan pereaksi Draggendorff, terbentuk warna merah ataupun
jingga pada kertas saring menunjukan adanya senyawa alkaloid. Larutan B dibagi dalam 2 tabung reaksi, ditambahkan masing-masing pereaksi
Draggendrorff dan Mayer, terbentuk endapan merah bata dengan pereaksi Dragendrorff dan endapan putih dengan pereaksi Mayer menunjukan adanya
senyawa golongan alkaloid Farnsworth, 1966. f.
Identifikasi golongan terpenoid Salkowski test Sebanyak 0,5 g masing-masing ekstrak ditambahkan 2 mL kloroform.
Tambahkan sebanyak 3 mL dengan hati-hati dan akan membentuk
lapisan. Warna cincin coklat kemerahan menunjukkan adanya terpenoid.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.5. Pengujian Ekstrak Terhadap Bakteri
3.4.5.1. Sterilisasi Alat dan Bahan Ratu dkk. 2010
Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 C
tekanan 1,5 atm selama 15-20 menit, semua alat dan bahan sebelum disterilisasi dibungkus terlebih dahulu dengan alumunium foil. Untuk bahan
yang terbuat dari karet seperti karet pipet tetes disterilisasi dengan cara direbus. Untuk larutan ujimedium disterilkan dengan cara memasukkan larutan
ujimedium ke dalam wadah yang sesuai yaitu tabung reaksi atau Erlenmeyer, kemudian sumbat wadah tersebut dengan sumbat yang sesuai atau dengan
kapas, kemudian disterilisasi dengan autoklaf.
3.4.5.2. Pembuatan Media Pertumbuhan Bakteri
a. Nutrient Agar NA Ratu dkk. 2010
Pada pembiakan bakteri menggunakan media digunakan Nutrient agar NA. Serbuk NA sebanyak 23 gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest dan
dipanaskan hingga semuanya larut. Lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit tekanan 1,5 atm. b.
Mueller Hinton Agar MHA Ratu dkk. 2010 Serbuk MHA sebanyak 38 gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest,
kemudian dipanaskan sampai mendidih sehingga semuanya larut, kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit tekanan 1,5 atm.
3.4.5.3. Peremajaan Bakteri Uji
Bakteri uji diremajakan pada medium MHA dengan cara menggoreskan bakteri menggunakan jarum ose pada permukaan agar,
kemudian semua biakan bakteri diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam.
3.4.5.4. Pembuatan Suspensi Bakteri Peoloengan et al., 2006
Biakan bakteri yang telah berumur 24 jam diambil dengan ose kemudian disuspensikan kedalam 5mL larutan NaCl fisiologis steril dan di
ukur kekeruhannya dengan menggunakan standar 0,5 Mc Farland.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.5.5. Pembuatan Larutan Uji Ekstrak
Pada pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi cakram. Larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak sampel tumbuhan
dengan menggunakan etanol 70. Pada penentuan Konsentrasi Hambat Minimum, larutan ekstrak uji dibuat dengan melarutkan ekstrak tumbuhan
dengan etanol 70. Konsentrasi yang digunakan adalah 3,125ppm, 6,25ppm, 12,5ppm, 25ppm, 50ppm dan 100ppm.
3.4.5.6. Pengujian Aktivitas Antibakteri
Gupta et al., 2008., Yuliati, 2012 Pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak
daun durian Durio zibethinus L, daun rambutan Nephelium lappaceum L dan daun lengkeng
Dimocarpus longan Lour dilakukan dengan metode difusi cakram. Kertas
cakram yang digunakan memiliki diameter lingkaran 6 mm. Disiapkan suspensi masing-masing bakteri dalam larutan NaCl,
kekeruhan distandarisasi dengan konsentrasi 0,5 Mc Farland, suspensi tersebut diambil dengan swab steril kemudian digoreskan ke media agar
secara merata. Diamkan plat kultur selama 5 menit, kertas cakram steril dicelupkan ke larutan ekstrak uji kemudian didiamkan selama 30 menit agar
pelarutnya menyerap ke cakram, lalu diletakkan diatas permukaan agar. Untuk kontrol negatif kertas cakram dicelup dengan etanol 70 dan sebagai kontrol
positif menggunakan cakram amoksisilin 25 μg
pada setiap bakteri uji. Masing
– masing cawan petri kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24
jam. Aktivitas antibakteri diamati keesokan harinya berdasarkan diameter zona hambat atau daerah bening yang terbentuk disekeliling kertas cakram.
Penggukuran zona hambat menggunakan jangka sorong. Pengujian dilakukan 3 kali pengulangan.
3.4.5.7. Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum KHM
Dari prosedur tersebut dapat dilihat nilai KHM Konsentrasi Hambat Minimum
ekstrak daun durian, daun rambutan dan daun lengkeng. Penentuan
KHM dilakukan terhadap ekstrak yang masih memiliki aktivitas zona hambat pada pengujian diameter daerah zona hambat sebelumnya dengan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
mengggunakan metode difusi cakram. Ekstrak sampel uji kemudian dibuat dalam konsentrasi 100ppm, 50ppm, 25ppm, 12,5ppm, 6,25ppm, 3,125ppm.
Kemudian dilakukan uji aktivitas seperti prosedur di atas. Penentuan KHM ditentukan berdasarkan konsentrasi terendah dari larutan ekstrak yang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri dimana pada konsentrasi tersebut sudah tidak ada lagi pertumbuhan bakteri. Pengamatan berdasarkan pada ada
tidaknya daerah bening yang terbentuk disekeliling kertas cakram.
33 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
