Pengujian Aktivitas Anti-Quorum Sensing

C. Pengujian Aktivitas Anti-Quorum Sensing

Enam fraksi etanolik dari bahan sampel segar dan kering diuji aktivitas anti-quorum sensingnya menggunakan bakteri indikator Chromobacterium violaceum . Bakteri ini digunakan dalam penelitian ini karena mempunyai karakteristik membentuk koloni berwarna ungu yang disebabkan oleh pigmen violacein. Pigmen tersebut tidak akan dihasilkan bakteri C. violaceum apabila terdapat penghambatan quorum sensing sehingga dapat mempermudah dalam pengamatan hasil uji. Karakteristik bakteri tersebut dijadikan sebagai indikator dalam pengujian fraksi tanaman dalam penelitian ini.

Metode yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan metode well diffusion (Adonizio et al., 2006). Metode ini digunakan karena mempunyai akurasi yang tinggi dan mempermudah pengukuran zona hambat karena penetrasi senyawa aktif tidak hanya di permukaan atas media tetapi juga sampai ke bawah (Lestari, 2009). Fraksi etanolik dari sampel tanaman dilarutkan dengan DMSO

commit to user

digunakan dengan tujuan agar tidak toksik pada bakteri saat pengujian. Fraksi disaring menggunakan syringe filter 0,22 µm untuk menjaga agar fraksi tetap dalam keadaan steril. Fraksi etanolik tersebut kemudian dibuat seri konsentrasi 2,

4, 6, 8, dan 10 mg/mL (Zahin et al., 2010). Media yang digunakan dalam pengujian yaitu media Luria Bertani. Media yang dituangkan ke dalam petri dish setelah memadat kemudian dilubangi dengan pelubang media berdiameter 8 mm untuk membuat sumuran. Petri dish yang digunakan mempunyai diameter 10 cm dan diisi media Luria Bertani agar (LA) sebanyak ± 20 mL. Ketebalan media di bawah 2 mm dapat mempengaruhi zona hambat yang dihasilkan (Richardson et al., 1986) sehingga ketebalan media yang dipilih yaitu 3 mm. Jarak antar sumuran diatur agar zona hambatnya tidak bersinggungan.

Proses inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 30-35°C karena suhu tersebut optimum untuk pertumbuhan bakteri C. violaceum (Carepo et al., 2004). Setelah inkubasi, maka akan terbentuk cincin zona pertumbuhan sel yang tidak berwarna di sekitar sumuran yang disebut zona penghambatan quorum sensing. Diameter penghambatannya dihitung dengan mengukur diameter zona pertumbuhan sel yang tidak berwarna di sekitar sumuran dikurangi diameter sumuran pada petri dish.

commit to user

Fraksi etanolik keenam jenis tanaman baik dari sampel segar maupun kering setelah diujikan kemudian diukur zona penghambatannya (Tabel 1). Tabel 1. Hasil pengukuran zona hambat quorum sensing C.violaceum

Jenis Tanaman

Kondisi

Sampel

Diameter penghambatan anti- quorum sensing (mm) pada konsentrasi tertentu (mg/mL)

2 4 6 8 10 Rumput mutiara

Segar

2,15 ab 3,48 ab 4,65 bc 5,60 c 6,26 bc

Kering

1,49 a 2,89 a 3,69 ab 4,67 b 5,47 ab Daun

ambre

Segar

4,20 c 5,33 c 6,58 d 8,23 d 9,13 d

Kering

2,58 b 3,57 b 4,43 b 5,25 bc 6,23 bc Daun

salam

Segar

3,05 bc 3,85 b 4,85 bc 5,79 c 6,72 c

Kering

2,33 ab 3,53 b 4,13 b 4,74 b 5,38 ab Umbi kimpul

Segar

2,75 b 3,47 ab 3,99 ab 4,57 b 5,54 b

Kering

3,03 bc 4,05 bc 5,14 c 5,74 b 6,37 bc Umbi uwi

Segar

Kering

- - Rimpang ganyong

Segar

2,72 b 3,53 b 4,03 b 4,86 b 5,57 b

Kering

2,19 ab 2,67 a 3,33 a 3,85 a 4,50 a Etanol 96%

DMSO 2%

Gentamisin (0,1 mg/ mL)

12,27

Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan indeks tidak berbeda nyata pada taraf uji 5%

Fraksi-fraksi etanolik yang mempunyai aktivitas anti-quorum sensing C. violaceum yaitu sampel segar dan kering dari tanaman rumput mutiara, daun ambre, daun salam, umbi kimpul, dan rimpang ganyong. Hasil pengukuran zona hambat menunjukkan bahwa diameter penghambatan yang terbentuk berkisar antara 1,49 mm - 9,13 mm (Tabel 1). Pada penelitian sebelumnya diketahui diameter penghambatan quorum sensing pada tujuh ekstrak tanaman asal Florida Selatan berkisar antara 1,2 mm - 8,7 mm (Adonizio et al., 2006). Sejauh ini

commit to user

Adonizio et al. (2006) dapat dikatakan bahwa zona hambat yang dibentuk oleh fraksi etanolik pada penelitian ini termasuk kategori zona hambat quorum sensing.

Pemberian fraksi etanolik dari sampel segar pada semua konsentrasi, optimal menghambat sistem quorum sensing karena terbentuk zona hambat di sekitar sumuran. Diameter penghambatan setelah pemberian fraksi etanolik sampel segar dari semua konsentrasi uji mengalami peningkatan sejalan dengan meningkatnya konsentrasi fraksi yang diberikan, tetapi tidak semuanya menunjukkan aktivitas anti-quorum sensing yaitu yang terlihat pada fraksi etanolik umbi uwi. Penghambatan terbesar ditunjukkan oleh sampel daun ambre segar pada konsentrasi 10 mg/mL. Hal tersebut menunjukkan bahwa senyawa aktif yang terkandung pada daun ambre paling efektif sebagai anti-quorum sensing dibandingkan tanaman lain pada kondisi sampel segar. Hal ini akan terlihat perbedaan aktivitas anti-quorum sensingnya jika dibandingkan dengan kondisi sampel yang dikeringkan.

Pada proses pengeringan sampel terjadi pengurangan kadar air karena sebagian air menguap selama pemanasan. Selama pemanasan tersebut, kandungan senyawa aktif akan mengalami penurunan (Depkes, 2000). Diameter penghambatan setelah pemberian fraksi etanolik sampel kering dari setiap konsentrasi uji juga mengalami peningkatan sejalan dengan meningkatnya konsentrasi fraksi yang diberikan. Penghambatan terbesar ditunjukkan oleh sampel umbi kimpul kering pada konsentrasi 10 mg/mL. Hal tersebut menunjukkan bahwa kandungan senyawa aktif dalam umbi kimpul paling efektif

commit to user

masih lebih rendah jika dibandingkan dengan sampel segar. Secara keseluruhan, fraksi etanolik tanaman dari sampel segar memiliki aktivitas yang lebih optimal daripada fraksi etanolik tanaman dari sampel kering. Aktivitas anti-quorum sensing terbesar ditunjukkan oleh fraksi etanolik daun ambre segar pada konsentrasi 10 mg/mL dibandingkan fraksi yang lainnya. Hal tersebut dapat dimungkinkan karena pada kondisi sampel segar, kandungan senyawa aktifnya banyak yang belum mengalami degradasi dibandingkan ketika sampel melalui proses pengeringan terlebih dahulu. Pengeringan yang terlalu lama akan menyebabkan banyaknya kerusakan senyawa aktif di dalam sampel.

Zona hambat yang dibentuk oleh gentamisin termasuk zona hambat pertumbuhan bakteri bukan zona hambat quorum sensing. Hal ini dapat dilihat adanya perbedaan zona hambat gentamisin dan sampel uji dimana zona hambat gentamisin 0,1 mg/mL optimum sebesar 12,27 mm. Penggunaan gentamisin dalam penelitian ini sebagai kontrol untuk membandingkan zona hambat pada antibakteri dan anti-quorum sensing. Pada kontrol etanol 96% dan DMSO 2% tidak menunjukkan aktivitas penghambatan. Hal ini menunjukkan bahwa kontrol tidak mempengaruhi terbentuknya zona hambat dan zona hambat yang terbentuk hanya disebabkan oleh senyawa yang terkandung dalam sampel.

commit to user

Fraksi yang mempunyai aktivitas penghambatan quorum sensing akan membentuk cincin zona keruh sampai tidak berwarna di sekitar sumuran (Gambar 11). Hal ini menunjukkan bahwa C. violaceum kehilangan kemampuannya memproduksi pigmen violacein.

A B Gambar 11. Hasil uji fraksi etanolik tanaman yang mempunyai aktivitas

anti-quorum sensing C.violaceum pada sampel segar (A) dan sampel kering (B) :

a. Rumput mutiara

b. Daun ambre

c. Daun salam

d. Umbi kimpul

e. Rimpang ganyong

f. Kontrol pelarut etanol 96%

g. Kontrol DMSO 2%

h. Gentamisin

Berdasarkan hasil pengujian, fraksi etanolik yang mempunyai aktivitas anti-quorum sensing C. violaceum yaitu sampel segar dan kering dari rumput mutiara, daun ambre, daun salam, umbi kimpul, dan rimpang ganyong.

commit to user

Rumput mutiara telah dimanfaatkan masyarakat dalam pengobatan berbagai penyakit, yaitu bronkitis, gondongan, pneumonia, dan radang usus buntu (Sadasivan et al., 2006). Menurut Nurhayati et al. (2006) melaporkan adanya aktivitas antibakteri dalam rumput mutiara terhadap bakteri Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Shigella disentriae, Pseudomonas aeruginosa dan Salmonella sp. dengan konsentrasi hambat minimum berkisar dari 0,2-0,8%. Hasil uji zona hambat fraksi etanolik rumput mutiara dari sampel segar dan kering menunjukkan bahwa zona hambat rumput mutiara segar terlihat lebih besar daripada rumput mutiara kering (Gambar 12). Hal tersebut menunjukkan bahwa senyawa yang terkandung dalam rumput mutiara segar memiliki aktivitas anti- quorum sensing C. violaceum lebih tinggi daripada sampel keringnya.

Gambar 12. Hasil uji fraksi etanolik rumput mutiara segar dan kering

A. Zona hambat fraksi etanolik rumput mutiara segar pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

B. Zona hambat fraksi etanolik rumput mutiara kering pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

commit to user

flavonoid glikosida, stigmasterol, β-sitosterol, asam ursolik,dan asam oleanik (Depkes, 2000). Penelitian yang dilakukan oleh Sadasivan et al. (2006) melaporkan bahwa asam ursolik pada rumput mutiara secara internal mengatasi inflamasi dan infeksi pada kulit. Asam oleanik dapat memperkuat daya tahan sel terhadap infeksi dan memperbaiki sel sehingga sel dapat beregenerasi. Stigmasterol sebagai antioksidan bersifat imunomodulator yaitu menguatkan sel- sel yang sehat untuk mencegah kanker. Flavonoid merupakan golongan senyawa bahan alam dari senyawa fenolik. Mojab et al. (2008) melaporkan bahwa kandungan flavonoid menyebabkan penghambatan terhadap sintesis dinding sel sehingga merupakan komponen antimikroba yang potensial.

2. Daun ambre Daun ambre dimanfaatkan masyarakat sebagai obat disinfeksi kuman dan

efektif menghilangkan bau tak sedap. Penelitian yang dilakukan oleh Zakaria (2007) melaporkan bahwa daun ambre mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Aeromonas hydrophila, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Enterobacter aerogenes. Hasil uji zona hambat fraksi etanolik daun ambre dari sampel segar dan kering menunjukkan bahwa zona hambat daun ambre segar terlihat lebih besar daripada daun ambre kering (Gambar 13). Hal tersebut menunjukkan aktivitas anti-quorum sensing C. violaceum daun ambre segar lebih tinggi daripada sampel keringnya. Diameter zona penghambatan rumput mutiara segar terbesar terlihat pada konsentrasi 10 mg/mL.

commit to user

Gambar 13. Hasil uji fraksi etanolik daun ambre segar dan kering

A. Zona hambat fraksi etanolik daun ambre segar pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

B. Zona hambat fraksi etanolik daun ambre kering pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

Daun ambre mengandung saponin, flavonoid, tanin dan minyak atsiri (Zakaria, 2007). Saponin umumnya berasa pahit dan dapat mengurangi radikal bebas dalam tubuh (Poeloengan et al., 2006). Adanya kandungan minyak atsiri menyebabkan denaturasi protein dinding sel bakteri. Flavonoid dapat sebagai antioksidan sehingga sangat baik untuk pencegahan kanker (Mojab et al., 2008). Tanin digunakan sebagai energi dalam proses metabolisme dalam tubuh. Penelitian yang dilakukan oleh Siwiyanti (2007) melaporkan bahwa tanin mampu menghambat sintesis pembentukan membran sel dari dinding sel. Abnormalitas membran sel ini menyebabkan terganggunya permeabilitas membran sel sehingga sel bakteri mengalami kekurangan nutrisi yang diperlukannya. Kemungkinan hal tersebut menyebabkan daun ambre mempunyai aktivitas sebagai antimikroba.

3. Daun salam Daun salam telah dimanfaatkan untuk pengobatan penyakit seperti diare dan diabetes (Purwati, 2004). Penelitian secara in vitro membuktikan bahwa

commit to user

seperti Eschericia colli, Salmonella dan Vibrio cholera (Sugarlini et al., 2001). Perbandingan hasil uji zona hambat fraksi etanolik daun salam dari sampel segar dan kering terlihat bahwa zona hambat daun salam segar lebih besar daripada daun salam kering (Gambar 14). Hal tersebut berarti aktivitas anti-quorum sensing

C. violaceum pada sampel segar lebih tinggi daripada sampel keringnya.

Gambar 14. Hasil uji fraksi etanolik daun salam segar dan kering

A. Zona hambat fraksi etanolik daun salam segar pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

B. Zona hambat fraksi etanolik daun salam kering pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

Penelitian yang dilakukan oleh Sugarlini et al. (2001) melaporkan daun salam mengandung flavonoid golongan kuersetin, tanin, minyak atsiri, dan eugenol. Flavonoid bermanfaat untuk melindungi struktur sel, mencegah osteoporosis, dan antiinflamasi. Siwiyanti (2007) melaporkan bahwa tanin dapat mengikat dan mengendapkan protein berlebih dalam tubuh. Senyawa eugenol sebagai antiseptik dan dapat digunakan dalam industri parfum dan farmasi. Minyak atsiri berperan sebagai antibakteri dengan cara mengganggu proses terbentuknya membran atau dinding sel (Oka dan Fanny, 2008).

commit to user

Umbi kimpul selain telah dimanfaatkan masyarakat sebagai sumber karbohidrat dapat pula mengobati penyakit diare (Goldsworthy dan Fisher, 1992). Hasil penelitian sebelumnya dilaporkan bahwa umbi kimpul menunjukkan aktivitas antifungal terhadap Sclerotium rolfsii (Kusumo et al., 2002). Hasil uji zona hambat fraksi etanolik umbi kimpul dari sampel segar dan kering menunjukkan zona hambat sampel kering lebih besar daripada sampel segarnya (Gambar 15).

Gambar 15. Hasil uji fraksi etanolik umbi kimpul segar dan kering

A. Zona hambat fraksi etanolik umbi kimpul segar pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

B. Zona hambat fraksi etanolik umbi kimpul kering pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

Zona hambat yang dibentuk fraksi etanolik umbi kimpul kering lebih besar daripada umbi kimpul segar dimungkinan karena kandungan air dan pati dalam umbi banyak berkurang ketika pengeringan sehingga senyawa aktifnya dapat terambil secara optimal. Ketika diujikan, fraksi etanolik dari sampel kering menunjukkan aktivitas anti-quorum sensing yang lebih tinggi daripada sampel segarnya. Menurut Kusumo et al. (2002) melaporkan kandungan senyawa pada

commit to user

inaktivasi karsinogen dan penghambatan siklus sel (Nurhayati et al., 2010). Polifenol merupakan senyawa antimikroba dan dapat menghilangkan radikal bebas (Rohdiana et al., 2007). Poeloengan et al. (2006) melaporkan saponin dapat menurunkan gula darah tubuh. Adanya penurunan kadar gula darah pada luka dapat menurunkan terjadinya infeksi. Senyawa-senyawa tersebut menjadikan umbi kimpul mempunyai aktivitas anti-quorum sensing.

5. Rimpang ganyong Rimpang tanaman ganyong dapat dimanfaatkan sebagai antioksidan, diuretik, dan obat penenang. Khasiat air rebusan rimpang ganyong segar digunakan untuk obat disentri dan hepatitis akut (Nuryadin, 2008). Perbandingan zona hambat rimpang ganyong segar terlihat lebih besar daripada rimpang ganyong kering (Gambar 16). Hal tersebut berarti bahwa aktivitas anti-quorum sensing C. violaceum pada sampel segar lebih tinggi daripada sampel keringnya.

Gambar 16. Hasil uji fraksi etanolik rimpang ganyong segar dan kering

A. Zona hambat fraksi etanolik rimpang ganyong segar pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

B. Zona hambat fraksi etanolik rimpang ganyong kering pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

commit to user

senyawa flavonoid dan saponin. Flavonoid berfungsi sebagai antiinflamasi, antibakteri, antialergi dan antioksidan. Saponin mempunyai kemampuan sebagai antiseptik yang dapat membunuh pertumbuhan mikroorganisme (Anbu et al., 2009). Kandungan senyawa tersebut dapat menghambat sintesis dinding sel bakteri sehingga berpengaruh terhadap aktivitas quorum sensing C. violaceum.

Berdasarkan hasil data di atas, secara keseluruhan menunjukkan bahwa signifikansi zona hambat fraksi etanolik sampel tanaman pada konsentrasi

8 mg/mL dan 10 mg/mL sebesar 0,081 yang berarti tidak berbeda nyata. Berdasarkan kondisi sampel tanaman, diketahui signifikansinya sebesar 0,453. Hal ini berarti fraksi etanolik dari sampel segar tidak berbeda nyata dengan fraksi etanolik dari sampel kering. Zona hambat yang dibentuk oleh fraksi etanolik pada jenis sampel tanaman diketahui tidak berbeda nyata antara rumput mutiara, daun salam, umbi kimpul, dan rimpang ganyong, tetapi berbeda nyata dengan jenis sampel tanaman daun ambre.

Pada penelitian ini diketahui fraksi etanolik tanaman dari sampel segar memiliki aktivitas yang lebih optimal daripada sampel kering. Penelitian yang dilakukan oleh Novitasari (2010) melaporkan bahwa ekstrak metanol rimpang lengkuas segar lebih optimal untuk menurunkan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila daripada ekstrak metanol rimpang lengkuas kering. Hal ini menunjukkan bahwa kandungan senyawa aktif pada sampel segar mempunyai aktivitas penghambatan bakteri lebih besar dibandingkan dengan sampel kering.

commit to user

C. violaceum

Pada hasil pengujian anti-quorum sensing, diketahui terdapat fraksi yang tidak mempunyai aktivitas anti-quorum sensing C. violaceum yaitu sampel segar dan kering dari umbi uwi. Tanaman uwi termasuk dalam famili Dioscoreaceae (Backer dan Bakhuizen, 1965). Hasil penelitian sebelumnya dilaporkan bahwa pada genus Dioscorea dilaporkan bahwa D. sylvatica dan D. dregeana mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli, sedangkan

D. alata

kurang efektif sebagai antibakteri ( Onwueme, 1978). Hasil uji pada fraksi etanolik umbi uwi dari sampel segar dan kering terlihat tidak terbentuk cincin zona pertumbuhan sel tidak berwarna di sekitar sumuran (Gambar 17).

A B Gambar 17. Hasil uji fraksi etanolik umbi uwi segar dan kering

A. Zona hambat fraksi etanolik umbi uwi segar pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

B. Zona hambat fraksi etanolik umbi uwi kering pada konsentrasi (mg/mL): a. 2; b. 4; c. 6; d. 8; e. 10

Pada fraksi yang tidak memiliki aktivitas anti-quorum sensing tidak terbentuk cincin zona pertumbuhan sel tidak berwarna di sekitar sumuran

commit to user

menunjukkan bahwa senyawa yang terkandung pada fraksi etanolik umbi uwi dari sampel segar maupun sampel kering tidak mempunyai aktivitas penghambatan quorum sensing . Umbi uwi mengandung senyawa diosgenin dan solasodin yang berperan dalam sintesa hormon steroid untuk obat konstrasepsi oral dan kortikosteroid (Lingga, 1992). Diosgenin termasuk golongan steroid yang berfungsi mengatur hormon seks dan mengembangkan massa otot tubuh. Penelitian yang dilakukan Kaspul (2007) melaporkan bahwa alkaloid solasodin bersifat kompetitif terhadap reseptor Folicle Stimulating Hormone (FSH) sehingga pelepasan FSH dari hipofisis akan terganggu. Jika FSH terganggu maka spermatogenesis menjadi terhambat. Senyawa-senyawa tersebut kemungkinan tidak menunjukkan pengaruh terhadap penghambatan quorum sensing bakteri

C. violaceum.