penyangga dan air bertindak sebagai fase diam yang terserap diantara struktur pori kertas Yazid, 2005.
Meskipun zat yang tercovery tidak betul-betul murni, dia dimanfaatkan juga untuk uji kualitatif dan kuantitatif. Keterbatasan metode ini adalah waktu
yang relatif lama dan resolusinya yang rendah. Susunan serat kertas membentuk medium berpori yang bertindak sebagai tempat untuk mengalirnya fase bergerak.
Berbagai macam kertas secara komersial tersedia adalah Whatman 1, 2, 31 dan 3mm. Kertas asam asetil, kertas kieselguhr, kertas silikon dan kertas penukaran
ion yang digunakan. Tersedia juga kertas selulosa murni, kertas selulosa yang dimodifikasi dan kertas serat kaca. Zat-zat hidrofobik dapat dipisahkan pada
kedua jenis kertas terakhir ini. Kertas asam asetil atau kertas silikon dapat digunakan untuk zat-zat hidrofobik, sedangkan untuk reagen yang korosif, kertas
serat kaca dapat digunakan. Untuk memilih kertas, yang menjadi pertimbangan adalah tingkat dan kesempurnaan pemisahan, difusivitas pembentukan spot, efek
tailing dan pembentukan komet serta laju pergerakan pelarut terutama untuk teknik descending. Pembentukan komet adalah suatu fenomena dimana spot
yangdiperoleh bukannya berbentuk bundar, melainkan bulatan berbentuk panjang. Penambahan asam dalam pelarut bisa menghindarkan pembentukan komet serta
mencegah ionisasi akibat hidrolisis ion-ion anorganik yang berbentuk komet. Seringkali nilai Rf berbeda dari satu kertas- kertas lainnya. Pengotor yang terdapat
pada kertas saring adalah ion-ion Ca
2+
, Mg
2+
, Fe
3+
, Cu
2+
. Kertas seharusnya penolak air Khopkar, 1990.
Kromatografi kertas tidak memerlukan pelat pendukung dan kertas dapat dengan mudah diperoleh dalam bentuk murni sebagai kertas saring. Lapisan
selulosa harus dicetak atau dibeli khusus. Panjang serabut pada kertas lebih panjang daripada serabut pada lapisan selulosa lazim, menyebabkan lebih banyak
terjadi difusi ke samping dan bercak lebih besar. Akhirnya, lapisan selulosa lebih rapat dan pelarut cenderung mengalir melaluinya lebih cepat dan menghasilkan
pemisahan tajam Gritter, 1991 Cairan fase bergerak yang biasanya berupa campuran dari pelarut organik
dan air, akan mengalir membawa noda cuplikan yang didepositkan pada kertas dengan kecepatan berbeda. Pemisahan terjadi berdasarkan partisi masing-masing
komponen diantara fase diam dan fase bergeraknya. Senyawa-senyawa yang dipisahkan kebanyakan bersifat sangat polar, misalnya asam-asam amino, gula-
gula atau pigmen-pigmen alam Yazid, 2005. Ditinjau dari sistem pelarut yang dipergunakan salam kromatografi partisi,
dikenal tiga kategori yaitu fase dan berair, fase diam pelarut organik hidrofilik, dan fase diam pelarut organik hidrofobik. Fase diam berair bersifat polar ataupun
ionik. Fase diam tersebut diperoleh dengan cara mengekspos kertas pada atmosfer air dalam ruang tertutup. Kertas tersebut tanpa direndam dalam larutan buffer dan
dapat dikeringkan sebelum digunakan. Dua metode dapat digunakan untuk memperoleh fase diam pelarut organik hidrofilik, tergantung pada volatilitas
pelarutnya, jika pelarutnya mudah menguap digunakan teknik eksposur, sedangkan bila pelarutnya tidak mudah menguap digunakan teknik perendaman
untuk conditioning. Fase bergerak dengan pelarut hidrofilik yang tepat adalah
formida, yang terdiri atas selulosa, karbitol, gliserol dan benzoil alkohol. Menjadikan kertas hidrofobik dapat juga dilakukan dengan impregnasi kertas
dengan pelarut hidrofobik yang terlarut dalam eluen mudah menguap serta dibiarkan kering di udara Khopkar, 1990.
2.6.1 Teknik Kromatografi Kertas
Proses pengeluaran asam mineral dari kertas disebut desalting. Larutan ditempatkan pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2–3 cm dari
salah satu ujung kertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, diletakkan di dalam ruang yang sudah dijenuhkan dengan air atau
dengan pelarut yang sesuai. Penjenuhan dapat dilakukan 24 jam sebelum analisis
Khopkar, 1990
Kertas dipotong memanjang sesuai ukuran bejana yang akan digunakan. Kertas yang dipakai adalah kertas Whatman yang secara komersial tersedia dalam
berbagai macam ukuran dan lembaran. Biasanya dipakai kertas Whatman no.1 dengan kecepatan sedang. Tersedia juga kertas selulosa murni, kertas selulosa
yang dimodifikasi , kertas asam asetil dan kertas serat kaca. Untuk pemilihan kertas yang menjadi pertimbangan adalah tingkat kesempurnaan pemisahan,
difusifitas pembentukan spot, efek tailing serta laju pergerakan pelarut. Kertas yang akan digunakan harus disimpan dalam ruang tertutup atau di temapat yang
kering jauh dari sumber uap terutama yang mempunyai afinitas tinggi terhadap selulosa Yazid, 2005.
Sejumlah cuplikan kurang lebih 1 µl diteteskan menggunakan mikropipet pada jarak 2–3 cm dari salah satu ujung kertas yang sudah diberi garis horizontal
dengan pensil. Spot atau noda yang terbentuk dikeringkan, lalu kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sudah dijenuhkan dengan pelarut yang sesuai untuk
dikembangkan. Penjenuhan dilakukan selama 24 jam sebelum analisis Yazid, 2005.
Terdapat tiga metode pengembangan pada kromatografi kertas ,yaitu : a.
Metode Penaikan Ascending Kertas digantungkan pada penggantung berbentuk kail yang dipasang
pada penutup bejana kromatografi. Pelarut berada di dasar bejana Gritter, 1991.
Noda harus diusahakan tidak sampai tercelup karena dapat larut dalam pelarut. Pelarut akan naik memalui serat-serat kertas oleh gaya kapiler
menggerakan komponen dengan jarak yang berbeda-beda Yazid, 2005 b.
Metode Penurunan Descending Bejana dilengkapi dengan sejenis wadah pelarut yang di pasang pada
penopang dan kertas kromatografi dicelupkan ke dalam pelarut di dalam wadah itu dan diberati dengan batang kaca supaya tetap pada
tempatnya . Pelarut bergerak turun membawa komponen melaui gaya kapiler dan gaya gravitasi Gritter, 1991.
c. Metode Mendatar Radial
Metode ini sangat berbeda dari sebelumnya. Biasanya kertas dibentuk bulat ditengahnya diberi sumbu dari benang atau gulungan kertas. Noda
ditempatkan pada pusat kertas kemudian pelarut akan naik melalui
sumbu sehingga membasahi kertas untuk kemudian mengembang melingkar membawa komponen yang dipisahkan Yazid, 2005
Temperatur harus dikendalikan dalam variasi tidak boleh lebih dari 0,5
o
C. Kertas harus didiamkan dahulu paling tidak 24 jam dengan atmosfer pelarutnya,
agar mencapai kesetimbangan sebelum pengaliran pelarutnya pada kertas. Dilakukan beberapa pengerjaan yang parallel, Rf nya tidak boleh berbeda lebih
dari ± 0,02 Khopkar, 1990. Bila permukaan pelarut telah mengembang atau bergerak pada batas
tertentu, maka kertas dikeluarkan dari bejana dan batas permukaan pelarut diberi tanda lalu kertas dikeringkan. Jika senyawa yang dipisahkan bewarna akan
nampak seperti noda- noda yang terpisah. Tetapi jika komponen zat tidak bewarna umumnya zat organik, maka dapat dideteksi dengan cara fisika dan kimia Yazid,
2005. Setelah letak noda komponen diketahui dan diberi tanda batas, harga R
f
Retardation factor dapat dihitung
Rf =
jarak yang ditempuh komponen jarak yang ditempuh pelarut
Nilai Rf dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif dari senyawa yang tidak diketahui dengan membandingkan terhadap senyawa standar. Bila harga Rf
sama, berarti kedua senyawa tersebutidentik sedangkan untuk analisis kuantitatif, komponen-komponen yang terpisah dapat dipotong-potong kemudian dilarutkan
secara terpisah dalam pelarut yang sesuai untuk ditetapkan kadarnya dengan metode lain, misalnya spektrofotometri Yazid, 2005.
BAB III METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Tempat Pengujian
Pengujian identifikasi zat warna pada saos secara kromatografi kertas dilakukan di Laboratorium Toksikologi, Balai Laboratorium Kesehatan Daerah
Pemprovsu Medan di Jalan Williem Iskandar Pasar V Barat I No.4 Medan.
3.2 Alat
Alat yang digunakan adalah beaker glass, chamber, erlenmeyer, gelas ukur, hot plate, kertas kromatografi, neraca analitik, pipet mikro, pipet tetes, pot
plastik.
3.3 Bahan
Bahan yang digunakan adalah aquadest, asam asetat 10, bulu domba, Larutan Pembanding Eritrosin , Larutan pembanding Rhodamin B, NH
4
OH
p
, metanol, sampel saus cabai, Tri-natrium citrat.
3.4 Prosedur 3.4.1 Larutan Uji
Saos ditimbang sebanyak 50 g, dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer, ditambahkan 10 ml asam asetat 10, ditambahkan 3-4 bulu domba bebas lemak,
didihkan selama 10 menit, bulu domba dicuci dengan aquadest, dimasukkan ke
dalam erlenmeyer lebih kurang 25 ml NH
4
OH 10 kemudian didihkan selama 10 menit. Zat warna yang larut dimasukkan kedalam larutan basa, dibuang bulu
dombanya, diuapkan diatas penangas air larutan yang bewarna, residu dilarutkan dalam sedikit metanol, ditotolkan pada kertas kromatografi, dilakukan
kromatografi, bandingkan dengan standart warna dan dihitung harga Rf nya.
3.4.2 Larutan Baku
Sejumlah ±1 mg Eritrosin dan Rhodamin B ditimbang seksama. Larutkan dan encerkan dengan aquadest secukupya.
3.4.3 Identifikasi
Larutan A, B, dan C masing-masing ditotolkan secara terpisah dan dilakukan kromatografi kertas sebagai berikut :
Fase diam : Kertas Whatman
Fase gerak : NH
4
OH pekat : Trinatrium Sitrat : Aquadest Penjenuhan
: Dengan kertas saring Volume penotolan
: Larutan A 50 µl , larutan B 50µl , larutan C 100µl Jarak rambat
: 12 cm Penampak noda
: UV 245 nm
3.5 Persyaratan
Saos cabai tidak boleh mengandung bahan pewarna sintetis yang berbahaya. Sesuai dengan Peraturan Menkes RI No. 239MenkesPerV85.
