BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Metodologi penelitian ini meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, pembuatan pereaksi, pemeriksaan karakterisasi simplisia, skrining fitokimia,
pembuatan ekstrak, isolasi senyawa flavonoid, analisis dengan kromatografi kertas KKt, uji kemurnian isolat dan karakterisasi hasil isolasi dengan
spektrofotometer ultraviolet UV menggunakan pereaksi geser shift reagent.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas, bejana kromatografi Dessaga, blender Philips, eksikator, krus porselin, lampu UV 366
nm Diamond, mikroskop cahaya, neraca kasar Home Line, neraca listrik Vibra AJ, oven Memmert, penangas air Yenaco, rotary evaporator Haake
D1, seperangkat alat penetapan kadar air, seperangkat alat refluks, spektrofotometer ultraviolet Shimadzu dan tanur.
3.2 Bahan-Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit buah jengkol Pithecellobii pericarpium. Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain
adalah berkualitas pro analisis, yaitu : α-naftol, aluminium III klorida, amonium
hidroksida, asam asetat anhidrat, asam asetat pekat, asam borat anhidrat, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida,
bismut III nitrat, n-butanol, etanol, eter, etilasetat, n-heksan, iodium,
Universitas Sumatera Utara
isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium asetat anhidrat, natrium hidroksida, natrium sulfat anhidrat, petroleum eter, raksa II
klorida, serbuk magnesium, serbuk zinkum, timbal II asetat dan toluena. Air suling, kertas Whatmann No.1 dan No.3, pipa kapiler.
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel 3.3.1 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel diambil dari pasar
tradisional di jalan Sei Kera, Kecamatan Medan Perjuangan, Kotamadya Medan, Provinsi Sumatera Utara.
3.3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Sumatera Utara, Medan. Bahan untuk identifikasi tumbuhan diperoleh dari daerah Barusta, Deli Serdang yang merupakan daerah tumbuh bahan yang
diambil dari pasar tradisional di jalan Sei Kera, Kecamatan Medan Perjuangan, Kotamadya Medan, Provinsi Sumatera Utara. Hasil identifikasi tumbuhan dapat
dilihat pada lampiran 1 halaman 45. Gambar tumbuhan dapat dilihat pada lampiran 2 gambar 1 halaman 46.
3.3.3 Pengolahan Sampel
Kulit buah jengkol dibersihkan dari kotoran dengan cara mencuci di bawah air mengalir hingga bersih, ditiriskan lalu ditimbang, selanjutnya dirajang
Universitas Sumatera Utara
dan dikeringkan di lemari pengering. Setelah kering, kulit buah jengkol ditimbang kembali lalu diserbuk hingga halus.
3.4 Pembuatan Pereaksi
Pembuatan larutan pereaksi menurut Depkes 1995 pereaksi Bouchardat, Dragendorff, Mayer, Molish, timbal II asetat 0,4 M, kloralhidrat; Depkes
1979a pereaksi asam klorida 0,2 N, asam klorida 2 N, natrium hidroksida 2 N, besi III klorida 1 bv; Merck dan Darmstadt 1978 Liebermann-Burchard;
dan Markham 1988 asam klorida 6 N, aluminium klorida 5 bv.
3.4.1 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, kemudian sebanyak 2 g iodium dilarutkan dalam larutan kalium
iodida, setelah larut dicukupkan volume dengan air suling hingga 100 ml.
3.4.2 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 g bismut III nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat. Pada wadah lain sebanyak 27,2 g kalium iodida dilarutkan dalam 50 ml air suling,
kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Selanjutnya diambil lapisan jernih dan diencerkan dengan air suling hingga 100
ml.
3.4.3 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,3596 g raksa II klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium
iodida lalu dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kemudian keduanya dicampur dan ditambahkan air suling hingga 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.4.4 Pereaksi besi III klorida 1 bv
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air hingga 100 ml.
3.4.5 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat
0,5 N hingga 100 ml.
3.4.6 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml.
3.4.7 Pereaksi asam klorida 0,2 N
Sebanyak 1,7 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 ml.
3.4.8 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 ml.
3.4.9 Pereaksi asam klorida 6 N
Sebanyak 50 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.
3.4.10 Pereaksi aluminium klorida 5 bv
Sebanyak 5 g aluminium klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga 100 ml.
3.4.11 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.4.12 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrat dicampurkan dengan 5 ml asam sulfat pekat, lalu ditambahkan 50 ml etanol ke dalam campuran tersebut.
3.4.13 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan dalam 20 ml air suling.
3.5 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia 3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari kulit segar, simplisia dan serbuk simplisia kulit buah jengkol. Gambar kulit segar
dapat dilihat pada lampiran 2 gambar 2 halaman 46. Gambar simplisia dapat dilihat pada lampiran 3 gambar 3 halaman 47 dan serbuk simplisia dapat dilihat
pada lampiran 3 gambar 4 halaman 47.
3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap kulit segar dan serbuk simplisia kulit buah jengkol. Kulit segar dipotong melintang lalu diletakkan di
atas objek glass yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop. Hasil pemeriksaan
mikroskopik kulit segar dapat dilihat pada lampiran 4 gambar 5 halaman 48. Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan
kloralhidrat dan tutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia dapat dilihat pada
lampiran 4 gambar 6 halaman 48.
Universitas Sumatera Utara
3.5.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluena WHO, 1992.
Cara kerja : Dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat,
lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluena dibiarkan mendingin selama 30 menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml.
Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena
mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap
detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima
dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air
yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen. Hasil perhitungan kadar air serbuk
simplisia dapat dilihat pada lampiran 5 halaman 49.
3.5.4 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1
liter dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama
diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah
Universitas Sumatera Utara
ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di
udara Depkes, 1979b. Hasil perhitungan kadar sari larut dalam air serbuk simplisia dapat dilihat pada lampiran 6 halaman 50.
3.5.5 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan
sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah
dikeringkan di udara Depkes, 1979b. Hasil perhitungan kadar sari larut dalam etanol serbuk simplisia dapat dilihat pada lampiran 7 halaman 51.
3.5.6 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600
o
C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara
Depkes, 1980. Hasil perhitungan kadar abu total serbuk simplisia dapat dilihat pada lampiran 8 halaman 52.
Universitas Sumatera Utara
3.5.7 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes, 1980. Hasil perhitungan kadar abu tidak larut dalam asam serbuk simplisia dapat dilihat pada
lampiran 9 halaman 53.
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk kulit jengkol meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, glikosida antrakinon Depkes, 1979b,
saponin Depkes, 1979b; Farnsworth, 1966, tanin, glikosida sianogenik dan triterpenoidsteroid Farnsworth, 1966. Hasil skrining fitokimia serbuk simplisia
dapat dilihat pada tabel 2 halaman 34.
3.6.1 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada
masing-masing tabung reaksi : a. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
b. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Universitas Sumatera Utara
Percobaan dilanjutkan dengan mengocok sisa filtrat dengan 3 ml amonia pekat dan 10 ml campuran eter dan kloroform 3:1, diambil lapisan kloroform
lalu diuapkan di atas penangas air. Sisa kemudian dilarutkan dengan sedikit asam klorida 2 N dan ditambahkan dengan pereaksi Mayer, Bouchardat dan
Dragendorff. Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga
percobaan diatas.
3.6.2 Pemeriksaan flavonoid
Serbuk simplisia ditimbang 0,5 g, lalu ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring. Filtrat
diencerkan dengan 10 ml air suling, setelah dingin ditambahkan 5 ml petroleum eter, dikocok hati-hati, lalu didiamkan sebentar. Lapisan metanol diambil,
diuapkan pada temperatur 40
o
C, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etilasetat, disaring. Filtratnya digunakan untuk uji flavonoid dengan cara berikut :
a. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol 96 , lalu ditambah 0,5 g serbuk Zn dan 2 ml asam klorida 2 N.
Didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat. Jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukka n
adanya flavonoid. b. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 1 ml
etanol 96 , lalu ditambah 0,1 g serbuk Mg dan 10 tetes asam klorida pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai warna merah ungu menunjukkan
adanya flavonoid.
Universitas Sumatera Utara
3.6.3 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 96 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks
selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit,
lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran kloroform : isopropanol 3:2 sebanyak 3 kali. Pada kumpulan sari ditambahkan natrium sulfat anhidrat,
disaring, dan diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dengan 2 ml metanol.
Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut : a. Diuapkan 0,1 ml larutan percobaan diatas penangas air, pada sisa ditambahkan
pereaksi Liebermann-Burchard, terjadi warna biru atau hijau yang menunjukkan adanya glikosida.
b. Dimasukkan 0,1 ml larutan percobaan dalam tabung reaksi, diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish.
Ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat, terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan menunjukkan adanya ikatan gula.
c. Percobaan terhadap gula pereduksi yaitu sampel disari dengan cara merebus dalam air, didinginkan dan disaring. Ditambahkan larutan fehling A dan
fehling B sama banyak kemudian dipanaskan, terbentuk endapan berwarna merah bata menunjukkan adanya gula pereduksi.
3.6.4 Pemeriksaan glikosida antrakinon
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,2 g, kemudian ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen,
Universitas Sumatera Utara
dikocok dan didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan, dikocok dengan 2 ml NaOH 2 N, lalu didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzen tidak
berwarna menunjukkan adanya antrakinon.
3.6.5 Pemeriksaan glikosida sianogenik
Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan dilembabkan dengan air. Kertas saring yang telah dibasahi dengan larutan natrium pikrat
diselipkan dengan bantuan gabus pada mulut labu. Dibiarkan terkena sinar matahari, akan timbul warna merah pada kertas saring yang menunjukkan adanya
glikosida sianogenik.
3.6.6 Pemeriksaan saponin 3.6.6.1 Uji Busa
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan, kemudian dikocok
kuat-kuat selama 10 menit. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2
N menunjukkan adanya saponin.
3.6.6.2 Uji dengan pereaksi Liebermann-Burchard
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit kemudian disaring panas-panas melalui kertas saring.
Filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling, dikocok dengan 10 ml n-heksan lalu diambil lapisan n-heksan dan diuapkan dalam cawan panguap. Pada sisa
ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard, apabila terbentuk warna biru, biru- hijau, merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya saponin.
Universitas Sumatera Utara
3.6.7 Pemeriksaan tanin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 3 menit dalam air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes
pereaksi besi III klorida 1 bv. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.
3.6.8 Pemeriksaan triterpenoidsteroid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dimaserasi dengan 20 ml n- heksan selama 2 jam, disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada
sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard melalui dinding cawan. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru ungu atau
biru hijau menunjukkan adanya triterpenoidsteroid.
3.7 Pembuatan Ekstrak
Sebanyak 400 g serbuk simplisia direndam dengan 800 ml etanol 80 Farnsworth, 1966 selama 3 jam. Selanjutnya dipindahkan massa tersebut sedikit
demi sedikit ke dalam perkolator, ditambahkan dengan etanol 80 secukupnya hingga simplisia terendam dan dibiarkan selama 24 jam. Kemudian dibiarkan
cairan menetes dan ditambahkan etanol 80 berulang-ulang hingga diperoleh perkolat yang tidak memberikan warna merah ungu bila ditambahkan dengan
serbuk Mg dan asam klorida pekat. Hasil perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan bantuan alat rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak etanol Depkes,
1986. Bagan kerja serbuk simplisia dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 54.
Universitas Sumatera Utara
3.8 Isolasi Senyawa Flavonoid dari Ekstrak Etanol
