NA tidak bisa langsung digunakan melainkan harus disterilkan terlebih dahulu dengan autoklaf. Media NA pada cawan petri yang digunakan sebagai media
kultur untuk menguji aktivitas antibakteri berisi masing-masing 10 ml. Sedangkan media yang akan digunakan sebagai media kultur bakteri agar miring pada tabung
reaksi adalah masing-masing 5 ml. Media NA agar miring digunakan untuk meremajakan bakteri biakan murni.
3. Tahap Perlakuan
a. Pengujian Aktivitas Antibakteri dengan Media Difusi Agar
Metode difusi agar spread plate secara aseptis digunakan untuk mengetahui aktivitas antibakteri. Media NA steril sebanyak 10 ml dalam cawan petri di
inokulum bakteri sebanyak 0,5 ml. Inokulum yang dipakai adalah inokulum pada konsentrasi 10
-8
cfumL. Setelah inokulum dimasukkan maka inokulum diratakan menggunakan batang L, perlakuan ini juga dilakukan dengan aseptis. Area cawan
petri dibagi menjadi 3 kuadran, yang terdiri dari kontrol negatif, kontrol positif, dan perlakuan, hal ini dilakukan agar tidak terjadi tumpang tindih pertumbuhan
atau penghambatan bakteri. Paper disc yang sudah direndam selama 10 menit dalam ekstrak konsentrasi tertentu dimasukan ke dalam media yang sudah
diinokulum, paper disc diambil menggunakan pinset dibiarkan sesaat sebelum dimasukkan ke dalam cawan petri sehingga dapat berdifusi ke dalam media
sekitarnya. Selanjutnya media tersebut di inkubasikan selama 1 hari 24 jam dalam incubator dengan suhu 37
C, setelah itu dilihat dan diukur diameter zona hambat yang mengelilingi paper disc tersebut dengan jangka sorong. Pada suhu
37 C karena pada suhu tersebut tidak mengalami perpanjangan fase lag pada
pertumbuhan bakteri dan viabilitas bakteri tidak menurun. Selama 24 jam karena sel bakteri diduga sudah dalam fase death. Hasilnya adalah zona hambat
antibakteri pada pertumbuhan bakteri, biasanya terlihat lebih bening daripada daerah sekitarnya. Ukuran zona jernih tergantung kepada kecepatan difusi
antimikroba, derajat sensitifitas, mikroorganisme dan kecepatan pertumbuhan bakteri Anonim, 2011. Keefektifan ekstrak dilihat dari zona hambat yang
didapat.
b. Pengujian Nilai MIC atau KHM
Ada dua macam metode dilusi yaitu metode dilusi cair dan metode dilusi padat. Pada penelitian ini menggunakan metode dilusi padat. Konsentrasi ekstrak
daun dan getah jarak tintir adalah 5, 10, 25, 50, 100, ditambah 1 kelompok kontrol positif, kontrol negatif, dan kontrol media. Konsentrasi minimal
yang di dapat dari uji aktivitas digunakan sebagai acuan untuk menentukan konsentrasi yang akan digunakan dalam pengujian nilai MIC atau KHM.
Pengujian dilakukan dengan metode dilusi padat, metode ini dilakukan dengan cara penanaman bakteri secara pourplate atau cawan tuang. Prosedur pourplate
adalah dengan mendinginkan media kultur yang sudah disterilkan dalam tabung reaksi sampai dengan suhu 45
C, kemudian dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi mikroba uji dan sampel ekstrak Cappuccino,2008. Media
kultur yang digunakan adalah 10 ml, sedangkan bakteri uji yang digunakan adalah bakteri uji pada konsentrasi 10
-8
cfumL yang di vortex dahulu sebelum digunakan sebanyak 0,5 ml sampel ekstrak sebanyak 0,5 ml. Setelah pourplate dilakukan
langkah selanjutnya adalah menginkubasinya selama 24 jam dalam suhu 37 C,
penentuan nilai MIC atau KHM dilihat dari konsentrasi terendah yang medianya tidak ditumbuhi bakteri.
