Metode Identifikasi KAJIAN PUSTAKA

keragaman genetik virus. PCR dan degenerate oligonucleotide primer telah digunakan untuk deteksi dan identifikasi genus Begomovirus Farag et al. 2005. Polymerase chain reaction PCR merupakan reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer, serta dilakukan di dalam thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer yang berada setelah target disebut primer reverse. Enzim sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru disebut sebagai enzim polymerase. Untuk mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP nukleotida berbasa Adenine, dCTP nukleotida berbasa Cytosine, dGTP nukleotida berbasa Guanin dan dTTP nukleotida berbasa Thymine Muladno, 2002. PCR merupakan suatu metode yang menggunakan komponen ‐komponen replikasi DNA untuk mereplikasi suatu fragmen DNA yang spesifik di dalam tabung reaksi. PCR dikembangkan untuk mempercepat isolasi DNA spesifik tanpa membuat dan melakukan pustaka genom. Dua primer oligonukleotida pendek digunakan untuk mengapit daerah DNA yang akan diamplifikasi. Primer menguatkan dan mencangkok target sekuen, satu dari setiap rantai DNA. Primer menentukan fragmen yang akan diamplifikasi dan DNA polymerase mereplikasi DNA dengan memanfaatkan empat deoksiribonukelotida dGTP, dATP, dCTP, dTTP yang disediakan di dalam tabung reaksi Nurulita, 2011. Pada sebuah siklus amplifikasi, DNA didenaturasi pada temperatur tinggi, annealing primer dilakukan dengan menurunkan temperatur dan DNA polymerase memperpanjang DNA dari primer. Pengulangan siklus denaturasi, annealing primer, dan sintesis DNA menghasilkan DNA melalui amplifikasi secara eksponensial. Sekitar 25 sampai 40 siklus pada umumnya digunakan di dalam thermalcycler, yaitu sebuah alat yang secara otomatis mengontrol temperatur dan waktu. Suatu DNA polymerase khusus yaitu Taq polymerase stabil pada suhu tinggi, yang diisolasi dari suatu bakteri thermofilik, Thermus aquaticus, yang hidup di sumber air panas. Produk hasil PCR dianalisis menggunakan elektroforesis gel Barnum, 2005. Identifikasi secara tepat spesies yang menginfeksi tanaman sangat penting untuk tindakan yang akan diterapkan dalam hal mengendalikan penyakit tersebut. Analisis perunutan nukleotida dan asam amino saat ini memiliki peranan yang tidak kalah penting didalam melakukan deteksi dan karakterisasi virus. Berdasarkan hasil analisis perunutan nukleotida dan asam amino dapat diketahui tingkat kesamaan nukleotida dan dapat menentukan kelompok suatu virus maupun strain-strain dari virus yang sama Shukla et al. 1994. Analisis tersebut digunakan sebagai pelengkap proses identifikasi dan karakterisasi virus. Tujuan paling penting DNA sequencing adalah mencari pattern yang diketahui di dalam sekuen. Pattern ini bisa terlibat di fungsi biologis yaitu mengkode protein dan RNA serta mengontrol eskpresi gen dan replikasi DNA.

2.4 Analisis Filogenetika

Filogenetika adalah bidang ilmu yang berkaitan dengan biologi yang menyediakan fasilitas dalam bidang genetika, ekologi, dan evolusi biologi. Filogenetik merupakan cara melihat sejarah evolusi populasi, alat untuk memahami proses biologis, menggambarkan hipotesis hubungan antar taksa genus, spesies, individu yang diilustrasikan sebagai pohon. Dharmayanti 2011 menyatakan, pohon filogenetik adalah diagram berbentuk pohon berakar atau tanpa akar yang terdiri atas cabang luar atau daun berarti taksa jamak, takson untuk tunggal, titik-titik dan cabang mewakili hubungan di antara taksa. Pohon filogenetik merupakan grafik dua dimensi yang menunjukkan hubungan antar organisme berdasarkan data genetik dan lainnya yang dihasilkan melalui analisis filogenetika. Proses evolusi melibatkan mutasi genetik dan proses rekombinan dalam spesies untuk membentuk spesies yang baru. Sejarah evolusi organisme dapat diidentifikasi dari perubahan karakternya. Karakter yang sama adalah dasar untuk menganalisis hubungan satu spesies dengan spesies lainnya. Pohon filogenetik adalah pendekatan logis untuk menunjukkan hubungan evolusi antara organisme Dharmayanti, 2011. Filogenetika diartikan sebagai model untuk merepresentasikan sekitar hubungan nenek moyang organisme, sekuen molekul atau keduanya Brinkman and Leipe, 2001. Salah satu tujuan dari penyusunan filogenetika adalah untuk mengkonstruksi dengan tepat hubungan antara organisme dan mengestimasi perbedaan yang terjadi dari satu nenek moyang kepada keturunannya LI et al. 1999. Menurut Hidayat dan Pancoro 2006, terdapat tiga tahap yang dilakukan dalam melakukan proses analisis filogenetika molekuler, yaitu sequence alignment, rekonstruksi pohon filogenetika, dan evaluasi pohon filogenetika dengan uji statistik.

2.4.1 Sequence alignment

Tahap ini merupakan tahap pennetuan tingkat homolog dari satu sekuen DNA atau protein dengan pembanding lainnya yang ada pada Gen Bank. Tahap ini melibatkan dua sekuen yang homolog disebut pairwise alignment, sedangkan yang melibatkan banyak sekuen yang homolog disebut multiple alignment. Keberhasilan analisis filogenetika sangat tergantung kepada akurasi proses alignment. Pada tahap alignment sering ditemukan adanya gap, yang ditandai oleh garis putus-putus. Gap terjadi karena adanya insersi dan atau delesi. Dalam prakteknya, gap bisa dianggap sebagai data yang hilang, walaupun dalam banyak kasus gap dapat dilibatkan dalam analisis karena bisa bersifat informative Dharmayanti, 2011. .

2.4.2 Rekonstruksi pohon filogenetika

Membangun sebuah pohon filogenetika berdasarkan karakter menggunakan urutan nukleotida atau asam amino secara langsung dalam rekonstruksi pohon, dapat menggunakan empat metode yaitu Distance method DM, Maximum Likelihood ML, Bayessian Inference BI, MP Maximum parsimony.