menguntungkan karena dapat menghasilkan linearitas antara konsentrasi dan absorbansi pengukuran, memberikan sensitivitas pengukuran yang tinggi, dan
mengurangi kesalahan pada saat pengukuran ulang Gandjar dan Rohman, 2007.
G. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis adalah suatu metode pemisahan yang sederhana, mudah dilakukan dan tidak membutuhkan bahan serta peralatan yang berbahaya,
sehingga banyak digunakan dalam berbagai proses analisis termasuk analisis obat, kosmetik, cemaran lingkungan, makanan hingga senyawa bahan alam. Pada proses
skrinning metabolit sekunder dalam suatu ekstrak tanaman, diperlukan tahap pemisahan. Komponen-komponen yang diperlukan dalam KLT antara lain fase diam,
fase gerak dan developing chamber. Fase diam berupa lapisan padat seperti kaca, plastik atau alumunium foil yang dilapisi dengan absorben silika, alumunium oksida
atau selulosa. Fase gerak terdiri dari satu atau campuran solven sedangkan developing chamber
digunakan sebagai tempat elusi berlangsung Lade, et al., 2014. Pemisahan pada KLT berdasarkan prinsip like dissolve like, yaitu didasarkan
pada kepolaran analit yang akan mempengaruhi interaksinya dengan fase diam dan fase gerak. Apabila kepolaran analit menyerupai kepolaran fase gerak maka analit akan
larut dan terbawa oleh fase gerak di sepanjang permukaan fase diam melalui gaya kapiler, semakin kuat interaksi analit dengan fase gerak maka semakin jauh analit akan
terbawa. Sebaliknya, jika kepolaran analit mirip dengan fase diam maka analit akan tertinggal di fase diam karena interaksinya yang kuat sementara komponen lainnya
akan terelusi. Secara kuantitatif, pemisahan diukur melalui nilai Rf atau retardation factor
, dua senyawa dengan nilai Rf sama pada suhu, fase gerak dan fase diam yang sama dapat diprediksikan sebagai senyawa yang identik namun untuk dapat
memastikan, diperlukan data pendukung lain seperti deteksi bercak pada sinar UV Lade, et al., 2014.
Penggunaan KLT untuk analisis kandungan bahan alam dilatarbelakangi oleh penggunaannya yang sederhana dan tidak membutuhkan biaya tinggi maupun
instrumen seperti kromatografi cair kinerja tinggi KCKT maupun kromatografi gas KG. Determinasi flavonoid secara KLT umumnya menggunakan fase diam silika dan
selulosa, sedangkan sistem fase gerak yang digunakan sesuai dengan golongan flavonoid yang akan dipisahkan. Deteksi flavonoid dapat dilakukan dengan
pengamatan bercak pada sinar UV 254 nm dan 366 nm karena sifatnya yang berfluoresensi. Penyemprotan bercak dengan reagen tertentu dapat memperkuat
fluoresensi sehingga mempermudah pengamatan di bawah sinar UV. Reaksi gugus fungsi pada reagen dengan gugus fungsi pada flavonoid menimbulkan reaksi warna
khas yang spesifik dari setiap reagen. Beberapa reagen yang digunakan untuk deteksi flavonoid antara lain : vanillin 5 HCl, AlCl
3
1, PEG, FeCl
3
, dan fast blue salt B Hajnos, et al., 2008.
Tabel II. Fase gerak yang digunakan pada KLT flavonoid Hajnos,
et al., 2008.
Tipe flavonoid Fase diam
Silika Selulosa
Flavonoid glikosida Etil asetat : piridin : air : metanol 80:20:10:5
vv t-butanol : asam asetat : air
3:1:1; n-butanol : asam asetat : air 4:1:5 vv
Flavonoid polar-
aglikon flavon,
flavonol Toluen : piridin : asam
formiat 36:9:5 vv t-butanol : asam asetat : air
3:1:1; kloroform : asam asetat : air 30:15:2 vv
Flavonoid non
polar-aglikon isoflavon,
dihidroflavonoid Kloroform : metanol
15:1 hingga 3:1 vv Asam asetat 10 - 30
H. Metode Uji Aktivitas Antioksidan
