Bahan dan Alat Penelitian .1 Bahan Penelitian Skema Alur Penelitian Analisis Data

jam dan tidak tumbuh koloni bakteri pada media perbenihan dengan menggunakan metode dilusi. - KBM Konsentrasi Bunuh Minimal adalah konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh 100 bakteri setelah dilakukan uji dilusi selama 24 jam, dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada media padat menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra. 3.6 Bahan dan Alat Penelitian 3.6.1 Bahan Penelitian - Buah jeruk nipis sebanyak 2000 gram - Pelarut etanol 96 sebanyak 5 liter - Suspensi P. gingivalis ATCC 33277 - Media Triptic Soy Agar TSA - NaCl 0,9 1 liter Kimia Farma, Indonesia 3.6.2 Alat Penelitian - Lemari pengering - Kertas perkamen - Vaccum Rotary Evaporator Heidolph VV 2000, Germany - Perkolator - Kapas Bio Panca, Indonesia - Alumunium foil 1 gulungan - Erlenmeyer Pyrex, USA - Destilator - Lemari penyimpan petri - Piring petri Pyrex, Japan - Blender Panasonic, Japan - Kertas saring Whatman no.42, England - Autoklaf Tomy, Japan - Inkubator CO 2 Sanyo, Japan Universitas Sumatera Utara - Electronic Balance Ohyo JP2 6000, Japan - Vortexwhirli mixer Iwaki model TM 100, Japan - Pipet mikro dan tips Gilson, France - Kaca pembesar Ootsuka ENV-CL, Japan - Ose - Spiritus 3.7 Proses Pengambilan dan Pengumpulan Data 3.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Buah Jeruk Nipis Buah yang dipakai adalah buah yang segar, berwarna hijau muda. Bahan baku berupa buah jeruk nipis sebanyak 2000 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, ditimbang, dikupas kulitnya, diiris halus dan dikeringkan di lemari pengering selama lebih kurang 10 hari. Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia. Kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 96. Diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Setelah 3 jam, simplisia diperkolasi dengan menggunakan perkolator yang ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Bagian ujung alat perkolator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring. Setelah 24 jam, bagian ujung perkolator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetesmenit. Sampel pada tabung perkulator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih. Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan 1 ATM dengan temperatur ≤50 o C. Hasil akhir yang didapat adalah ekstrak kental kulit buah jeruk nipis. Universitas Sumatera Utara a b Gambar 3. a. Pencucian dan b. Penimbangan jeruk nipis a b Gambar 4. Prosedur penghalusan kulit jeruk nipis kering menjadi serbuk simplisia a. Penghalusan kulit jeruk nipis kering b. Bubuk simplisia kulit jeruk nipis a b Gambar 5. a. Pengadukan dan perendaman dengan etanol. b. Perkolator Universitas Sumatera Utara Gambar 6. Vaccum rotary evaporator

3.7.2 Pengenceran Bahan Coba

Ekstrak kulit jeruk nipis ditimbang menggunakan Electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Triptic Soy Broth TSB. Disediakan 5 buah tabung, pada tabung pertama diisi 2 ml ekstrak kulit jeruk nipis sehingga diperoleh ekstrak kulit jeruk nipis dengan konsentrasi 100. Empat buah tabung yang lainnya kemudian diisi masing-masing 1 ml TSB. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara mengambil setengah dari ekstrak kulit jeruk nipis konsentrasi 100 menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan ekstrak kulit jeruk nipis 50 pengenceran ganda. Demikian seterusnya sampai didapatkan konsentrasi 25, 12,5 dan 6,25. Tabung-tabung tersebut kemudian diberi label sesuai konsentrasinya.

3.7.3 Pembuatan Media Bakteri

Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media Triptic Soy Agar TSA sebanyak 20 gram dilarutkan ke dalam 500 ml aquades untuk 40 petri 20mlpetri, lalu disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121 o C. Setelah disterilkan, media disimpan dalam lemari pendingin. Jika akan Universitas Sumatera Utara digunakan kembali, maka media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin. Gambar 7. Penimbangan Gambar 8. Sterilisasi TSA di dalam bubuk TSA autoklaf Gambar 9. TSA yang sudah dikeluarkan dari autoklaf Universitas Sumatera Utara Gambar 10. TSA cair yang sudah dipindahkan ke petri

3.7.4 Pembiakan Spesimen

Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO 2 . Porphyromonas gingivalis yang digunakan adalah spesimen yang telah dibiakkan secara murni pada media Triptic Soy Agar TSA yang telah disiapkan dalam prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1 – 2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10 8 CFUml.

3.7.5 Penentuan KHM Bahan Coba

Bahan coba ekstrak kulit buah jeruk nipis yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25. Masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing- masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks. Lalu tabung- tabung tersebut dibandingkan dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan P. gingivalis dalam Universitas Sumatera Utara media pembenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam pembenihan tersebut.

3.7.6 Penentuan KBM Bahan Coba

Setelah KHM didapatkan, maka penelitian dilanjutkan dengan penentuan KBM bahan coba dengan metode Drop Plate Mills Mesra. Bahan coba dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5 dan 6,25 masing-masing divorteks dan diambil 50 µl lalu diteteskan ke dalam media padat Mueller Hinton Agar direplikasi 5 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO 2 dengan suhu 37 o C selama 24 jam. Perhitungan jumlah koloni bakteri dilakukan dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah reratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena itu, konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml. Universitas Sumatera Utara

3.8 Skema Alur Penelitian

3.9 Analisis Data

Data hasil pengujian antibakteri dianalisis dengan menggunakan uji statistik sebagai berikut: 1. Uji analisis varian satu arah ANOVA, untuk melihat perbedaan efek antibakteri ekstrak kulit jeruk nipis terhadap pertumbuhan P. gingivalis. Pembuatan ekstrak kulit jeruk nipis Pembuatan media bakteri Pembiakan spesimen Penentuan KHM bahan coba Penentuan KBM bahan coba Analisis data Universitas Sumatera Utara

BAB 4 HASIL PENELITIAN

4.1 Ekstrak Kental Kulit Jeruk Nipis

Ekstrak kulit jeruk nipis diperoleh dari 2 kilogram jeruk nipis yang telah dikupas kulitnya dan dikeringkan, lalu dihaluskan menjadi serbuk simplisia, kemudian dimaserasi dan diperkolasi dengan melarutkan kulit jeruk nipis yang sudah dihaluskan dalam pelarut etanol 96 sebanyak 5 liter, sehingga dihasilkan maserat cair sebanyak 4 liter. Maserat cair kemudian diuapkan pada vaccum rotary evaporator, sehingga diperoleh ekstrak kental berwarna coklat sebanyak 20 gram. Sebelum digunakan, ekstrak kental tersebut dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup dan disimpan di dalam lemari pendingin. Gambar 11. Penimbangan ekstrak.

4.2 Uji Efektifitas Antibakteri

Pada penentuan KHM, kekeruhan bahan coba di dalam tabung tidak berubah sehingga dianggap tidak representatif untuk mengukur nilai KHM. Oleh karena itu, nilai KHM tidak dapat ditentukan. Universitas Sumatera Utara