Hasil perhitungan: n = [ 1,96 2 0,200,80 + 0,842 0,300,70 + 0,100,90 ]2
0,202
= [0,784 + 0,459]2 0,202
= 38,65 39 sampel minimal
Dalam penelitian ini sampel di tambah sebanyak 10 dari jumlah awal sehingga menjadi 42 sampel
3.6. Cara Kerja
Pada penelitian ini, setiap blok parafin sampel jaringan prostat dipotong tipis dan terlebih dahulu diwarnai dengan hematoksilin eosin. Pemeriksaan
mikroskopis dengan pewarnaan hematoksilin eosin diamati minimal oleh dua orang pathologist bersama dengan peneliti dan dikelompokkan menjadi
BPH dan adenokarsinoma prostat. Setelah itu baru dilakukan pemotongan ulang
blok parafin
sampel jaringan
prostat untuk
pewarnaan imunohistokimia p63 dan diamati oleh peneliti.
Universitas Sumatera Utara
3.6.1. Pembuatan Sediaan Mikroskopis Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut:
1. Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer
sampai cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4 μm. Setiap blok parafin
dipotong ulang 1 kali untuk pulasan imunohistokimia p63. 2.
Sampel blok parafin yang sudah dipotong tipis 4 μm ditempelkan pada kaca objek.
Pada pulasan imunohistokimia p63 digunakan kaca objek yang telah di-
coating dengan poly-L-lysine atau sialanized slide agar jaringan dapat menempel pada kaca objek selama proses pulasan imunohistokimia.
Proses pembuatan sialanized slide kaca objek adalah sebagai berikut: 1.
Kaca objek direndam seluruhnya dalam aseton selama 10 menit. 2.
Masukkan kaca
objek dalam
larutan APES
3- aminopropyltriethoxysilene, cat no.A3548 sigma 5 ml + aseton 195
ml selama 10 menit. 3.
Kaca objek selanjutnya dicuci dengan aquadest. 4.
Keringkan dalam inkubator bersuhu 37 C selama satu malam.
5. Kaca objek siap digunakan.
Universitas Sumatera Utara
Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek sialanized adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing. Potongan tipis
dipisahkan dan diratakan dengan memasukkannya ke dalam air hangat. Setelah mengembang, pindahkan ke atas kaca objek. Selanjutnya kaca
objek diletakkan di atas alat pemanas hot plate suhu 50 C
– 60 C.
Setelah parafin melunak, kaca objek dikeringkan dan potongan jaringan siap untuk dipulas.
3.6.2. Prosedur Sebelum Pulasan Antibodi Primer
1. Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4
μm yang sudah ditempelkan pada kaca objek sialanized.
2. Preparat dimasukkan dalam inkubator satu malam dengan suhu 37
C. 3.
Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan xylol sebanyak 3 kali, masing-masing 5 menit.
4. Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam etanol
98 sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, kemudian alkohol 90, 80 dan 70, masing-masing selama 5 menit.
5. Bilas dengan PBS 2 kali, masing-masing selama 3 menit.
6. Masukkan ke dalam larutan buffer sitrat yang telah dipanaskan
sebelumnya dengan microwave selama 5 menit sebanyak 2 kali, masing-masing 5 menit.
Universitas Sumatera Utara
7. Dinginkan selama 20 menit dalam suhu ruangan.
8. Bilas dengan PBS 2 kali selama 3 menit dan keringkan air di sekitar
potongan jaringan. 9.
Tandai di sekeliling jaringan yang ingin dipulas dengan Pap Pen. 3.6.3. Protokol Pulasan Imunohistokimia p63 Dengan Menggunakan Metode
Polymeric Langkah 1: Endogenous Enzyme Block
1. Bersihkan preparat dari sisa buffer pencuci dengan menggunakan lap
khusus. 2.
Teteskan dual endogenous enzyme block secukupnya untuk menutupi seluruh spesimen.
3. Inkubasi selama 5-10 menit.
4. Bilas dengan PBS tanpa mengenai spesimen langsung.
5. Letakkan preparat dalam bath buffer yang baru.
Langkah 2: Reagen antibodi primer atau kontrol negatif
1. Bersihkan preparat dari sisa buffer pencuci dengan lap khusus.
2. Teteskan antibodi primer yang sudah diencerkan secukupnya
menutupi seluruh jaringan. 3.
Inkubasi selama 30 menit. 4.
Bilas secara hati-hati dengan PBS dan tempatkan dalam bath buffer maksimal 1 jam pada suhu ruangan.
Universitas Sumatera Utara
Langkah 3: Labelled Polymer-HRP 1.
Bersihkan preparat dari sisa buffer pencuci dengan lap khusus. 2.
Teteskan labelled polymer secukupnya. 3.
Inkubasi selama 30 menit. 4.
Bilas secara hati-hati dengan PBS dan tempatkan dalam bath buffer selama 5 menit.
Langkah 4: Substrat-kromogen 1.
Lap kering slide preparatnya seperti biasa. 2.
Teteskan larutan DAB + substrat-kromogen secukupnya dan inkubasi selama 5-10 menit.
3. Bilas lembut dengan air destilasi.
Langkah 5 : Counterstain hematoksilin 1.
Masukkan slide ke dalam cairan Meyer hematoksilin dan inkubasi seperti biasa.
2. Bilas dan bath air destilasi.
3. Celupkan slide 10 kali dalam larutan amonia 0,037 molL atau
bluding agent lainnya. 4.
Bilas slide dalam bath air destilasi atau deionisasi selama 2-5 menit.
Universitas Sumatera Utara
Langkah 6: Mounting 1.
Teteskan dengan entelan atau media mounting lainnya dan tutup dengan kaca penutup.
3.7. Alat dan Bahan Penelitian
